撰文 | 陳哲 博士
責編 | 兮
基因的時空差異表達使得同一套基因組能夠形成不同類型的組織細胞，轉錄因子在這個過程中起核心作用。轉錄因子特指能夠序列特異性結合DNA並能調控RNA轉錄的蛋白質，它至少包含DNA-binding domain和effector domain兩個功能結構域（下圖）。不同轉錄因子結合DNA後產生的效應由effector domain募集的因子決定。一些轉錄因子（如TBP）能夠直接募集RNA聚合酶，而其它大部分轉錄因子則通過徵募cofactor（輔因子）來調控RNA轉錄，例如coactivator和corepressor【1,2】。人類蛋白質組含有超過1600個轉錄因子，雖然對其中一部分轉錄因子的DNA結合位點進行了一些高通量研究【3,4】，但是對絕大部分轉錄因子的效應功能並沒有研究。
LambertSA, et al. Cell, 2018
研究轉錄因子效應功能的傳統方法是徵募實驗：將待研究的轉錄因子或相關結構域與一個DNA結合結構域在細胞中融合表達，然後檢測報告基因的表達活性【5】。但是由於要逐個克隆待研究的轉錄因子或效應結構域，然後將其轉染進細胞並進行測量，所以實驗通量很有限，這嚴重限制了我們對基因轉錄調控網絡的整體認識。
2020年12月15日，來自美國史丹福大學的Lacramioara Bintu教授團隊在Cell上發表了題為High-ThroughputDiscovery and Characterization of Human Transcriptional Effectors的工作，開發了一種名叫HT-recruit（ahigh-throughput recruitment assay）的實驗技術，能夠平行檢測成千上萬個轉錄效應結構域的功能。
HT-recruit技術有兩個要點：首先，研究者改造了一個便於高通量篩選效應結構域的報告基因Igκ-hIgG1-Fc-PDGFRβ，其蛋白產物定位於細胞膜上，能夠被proteinA/G的磁珠親和分離純化；其次，構建了一個人類轉錄因子效應結構域的慢病毒文庫，將長度小於80個胺基酸的效應結構域與rTetRdox-inducible DNA-binding domain融合表達。這樣，在細胞培養基中加入dox後，待研究的效應結構域將被rTetR募集到報告基因的啟動子上。5天後，通過磁珠分離報告基因表達未被抑制的細胞，而未被磁珠分離的則是報告基因表達被抑制的細胞。然後通過高通量測序，檢測各個效應結構域表達載體在磁珠分離與未分離細胞中的比例，從而評估各個效應結構域的轉錄調控功能（下圖）。如果在5天後撤去培養基中的dox，並於第9天和第13天進行分離評估，還可以檢測各個效應結構域對報告基因所造成的表觀記憶。
通過HT-recruit技術，研究者在文庫中鑑定出了446個repressor和48個activator，發現：1.KRAB結構域並不都是轉錄抑制子，進化上年輕的KRAB結構域是轉錄抑制子，而進化年代久遠的KRAB結構域是轉錄激活子；2.Homeodomain的轉錄抑制活性與Hox基因在染色體上的定位共線性，定位於5』端的Hox基因的Homeodomain的轉錄抑制活性強於定位於3』端的。此外，研究者展示了使用HT-recruit技術通過tiling文庫發現細胞核蛋白上未被注釋區域的效應結構域、以及使用HT-recruit技術通過深度突變掃描（DMS，DeepMutational Scan）發現ZNF10 KRAB結構域上關鍵胺基酸殘基位點的應用實例（下圖）。
這項技術為高通量注釋轉錄因子的效應功能提供了一種實驗方法，並且能夠用於發現感興趣蛋白質上的未被注釋區域的潛在效應結構域，通過深度突變掃描還能尋找特定效應結構域上的關鍵胺基酸殘基。但是限於目前的文庫合成技術，這項工作僅對長度小於80個胺基酸的效應結構域進行了研究，並且有一部分效應結構域由於表達效果不好，並沒有進行後續的功能鑑定。本項工作一共鑑定了600個人類轉錄因子上的3014個效應結構域的功能活性，但是這個數字離人類的1600個以上的轉錄因子還有一定距離。隨著技術的進步，相信不久以後能夠對轉錄因子的功能有更全面的認識，從而更深入的理解基因表達調控網絡，開發出更好的方法來矯正疾病狀態下基因表達的異常。
https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.11.024
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