Cell-autonomous adiposity through increased cellsurface GLUT4 due to ankyrin-B deficiency
作者：Damaris N. Lorenzoa, Vann Bennetta(Howard Hughes Medical Institute, Duke University, Durham, NC 27710; and Department of Biochemistry, Duke University, Durham, NC 27710)
發表情況：Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2017 11 28;114(48). DOI：10.1073/pnas.1708865114
AnkB R1788W / R1788W小鼠出現了年齡依賴性肥胖症和胰島素抵抗（IR），但在食物消耗或代謝活性方面沒有可察覺的差異。在高胰島素的正常血糖鉗夾研究中AnkB突變小鼠葡萄糖消耗增加，表明白色脂肪組織（WAT）和骨骼肌（SKM）中的葡萄糖吸收增加。AnkB突變小鼠分化的脂肪細胞的質膜（PM）的GLUT4水平和葡萄糖攝取增加，並且出現脂質蓄積。因此，假設在ANKB突變小鼠肥胖是由於質膜GLUT4增加從而葡萄糖攝取增加而導致肥胖。不過，尚不清楚AnkB功能喪失如何增加脂肪細胞和SKM PM的GLUT4水平。
熱量攝入超過能量需求是影響美國和其他國家的肥胖病流行的主要根源。但是，遺傳因素也可能是助於肥胖的病因。這項研究表明，脂肪組織（AT）中的錨蛋白B（AnkB）缺乏會引起細胞自主性肥胖，使小鼠隨著年齡增長或進食高脂飲食而更容易變得肥胖，並引起其他代謝併發症。由於缺乏網格蛋白介導的GLUT4內吞作用，AT中AnkB的丟失會增加葡萄糖攝取和脂肪生成。我們還表明，數以百萬計的美國人中存在的AnkB突變會引起類似的細胞代謝損害。
Obesity typically is linked to caloric imbalance as a result of overnutrition. Here we propose a cell-autonomous mechanism for adiposity as a result of persistent cell surface glucose transporter type 4 (GLUT4) in adipocytes resulting from impaired function of ankyrin-B (AnkB) in coupling GLUT4 to clathrin-mediated endocytosis. Adipose tissue-specific AnkB-KO mice develop obesity and progressive pancreatic islet dysfunction with age or high-fat diet (HFD). AnkB-deficient adipocytes exhibit increased lipid accumulation associated with increased glucose uptake and impaired endocytosis of GLUT4. AnkB binds directly to GLUT4 and clathrin and promotes their association in adipocytes. AnkB variants that fail to restore normal lipid accumulation and GLUT4 localization in adipocytes are present in 1.3% of European Americans and 8.4% of African Americans, and are candidates to contribute to obesity susceptibility in humans.
圖1 AT中AnkB的條件性KO導致年齡依賴性肥胖和代謝異常
AT中的AnkB缺乏會引起小鼠年齡依賴性肥胖和異位脂質蓄積。（A）4月齡小鼠的WAT和大腦中的AnkB和GAPDH蛋白水平。（B）4月齡的對照和AnkB KO雄性小鼠。（C）4月齡和10月齡的小鼠的eWAT切片的periplipin免疫螢光染色。比例尺，20 µm。（D）體重。（E）eWAT大小。（F，左）5月齡小鼠的脫細胞脛骨前肌樣品，（F，右）切片用油紅O染色。（G）5月齡小鼠肝切片H＆E和油紅O染色。比例尺，100 µm。數據表示為平均值±SEM（n= 8-13隻小鼠）（*** P <0.001，未配對t檢驗）。結果代表三個獨立實驗。
圖2 肥胖的增加會觸發AnkB KO小鼠的代謝失調
（A）基礎葡萄糖水平。（B和C）OGTT（B）或ITT（C）期間血糖水平曲線下的面積。（D）胰島AnkB的免疫螢光染色。比例尺，20μm。（E）口服葡萄糖後30分鐘，血清胰島素水平。（F）WAT的基礎脂解過程中甘油的釋放。（G）血清TNF-α和IL-6水平。數據代表平均值±SEM（n = 8隻小鼠；** P <0.01和*** P <0.001，未配對t測試）。結果代表三個獨立實驗。
圖3 AnkB缺陷小鼠在WAT和SKM中細胞表面GLUT4的年齡依賴性變化
（A和B）WAT和SKM中總GLUT4水平的免疫印跡（A）和定量（B）。（C – F）在基礎條件下和胰島素刺激後，WAT和SKM的質膜中GLUT4水平的免疫印跡（C和D）以及定量（E和F）。（G）4月齡小鼠WAT中的磷酸化胰島素受體底物1（pIRS- 1Ser307）水平的免疫印跡。（H）WAT和SKM中磷酸化AS160（p-AS160 Thr642）水平的免疫印跡。數據代表平均值±SEM（n = 5小鼠；*** P <0.001，未配對t檢驗）。結果代表三個獨立實驗。
圖4 在AnkB KO分化的脂肪細胞中PM GLUT4和葡萄糖攝取增加
（A）對照（AnkB + / +），AnkB-null（AnkB - / -）和WT AnkB拯救了的AnkB - / -脂肪細胞的油紅O染色（第8天）。比例尺，50μm。（B）脂滴尺寸。（C和D）在基礎和胰島素刺激狀態下，AnkB的損失對葡萄糖攝取（C）和PM GLUT4定位的影響（D）。數據表示平均值±SEM（n=三個獨立實驗之一的100個脂肪細胞；Tukey後測的單向方差分析）。
圖5 GLUT4與網格蛋白在脂肪細胞中的結合需要AnkB
（A）免疫沉澱研究表明，GLUT4–AnkB–CHC17三元複合物的形成。（B）PLA揭示了指示蛋白對之間納米級解析度的原位相互作用。（C）基於PLA的脂肪細胞中GLUT4-CHC17締合的量化。（D和E）使用純化的蛋白質和生物素化的N末端GLUT4肽，FL 220-kDa AnkB-His（D）和ZU5-DD AnkB-His構建體（E）與GLUT4直接結合。數據代表平均值±SEM（n = 22–25個細胞；*** P <0.001，未配對t測試）。結果代表三個獨立實驗。（F）在脂肪細胞中AnkB介導的GLUT4內化的模型圖。AnkB與GLUT4和CHC17的雙重關聯促進了從PM運回GLUT4。
圖6 人類AnkB突變導致分化的脂肪細胞中脂質蓄積的細胞自主增加
（A）顯示疾病相關變體的位點的AnkB結構。C-末端結構域內的推測致病性AnkB變體以紅色顯示。（B）歐洲（EA）和非洲（AA）血統的美國人的變異頻率。表明了這些變體對脂肪細胞的預測功能作用。（C）脂質液滴的大小。數據代表平均值±SEM（三個獨立實驗之一，n = 100個細胞）。
這項研究確定了一種細胞自主性機制，該機制可在具有針對AT的AnkB KO的小鼠中引起肥胖。這些突變小鼠發展出年齡和飲食依賴性的肥胖症和IR，並伴有進行性全身性脂毒性和炎症，從而影響胰腺，SKM，肝臟和BAT。除了此處描述的WAT自主機制外，BAT功能障礙也可能與觀察到的代謝表型有關。從目前的數據不可能區分WAT肥大與BAT功能失調的相對貢獻。本文證明，WAT中的AnkB缺乏會由於GLUT4與PM的持續結合而導致葡萄糖攝取增加，這與脂質積累增加有關。本文發現AnkB直接結合到GLUT4和CHC17，並促進它們在脂肪細胞中的締合。本文進一步發現，阻止其與dynactin和PtdIns相互作用的AnkB突變也消除了AnkB搶救GLUT4販運的能力。綜上所述，這些結果表明，AnkB通過與GLUT4，CHC17，動力蛋白複合物和PtdIns相互作用，對於正常GLUT4分布和脂肪細胞攝取葡萄糖至關重要。最後，我們發現了AnkB在AT生物學中的這一作用與潛在的公共衛生相關性，並發現在數百萬的美國人中累積存在的多個AnkB人類變體未能恢復脂肪細胞中的正常脂質蓄積和GLUT4定位。