食品中亞硝酸鹽的快速檢測-鹽酸萘乙二胺法
1 範圍
本方法規定了食品中亞硝酸鹽的快速檢測方法。
本方法適用於肉及肉製品（餐飲食品）中亞硝酸鹽的快速測定。
2 原理
樣品中的亞硝酸鹽經提取後，在弱酸性條件下與對氨基苯磺酸重氮化後，再與鹽酸萘乙二胺反應生成紫紅色偶氮化合物，其顏色的深淺在一定範圍內與亞硝酸鹽含量成正相關，通過色階卡進行目視比色，對樣品中亞硝酸鹽進行定性判定。
3 試劑和材料
除另有規定外，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T6682規定的二級水。
3.1 試劑
3.1.1 對氨基苯磺酸。
3.1.2 鹽酸萘乙二胺。
3.1.3 鹽酸。
3.1.4 鹽酸（20%）：量取20mL鹽酸，用水稀釋至100mL。
3.1.5 對氨基苯磺酸溶液（4g/L）：稱取0.4g對氨基苯磺酸，溶於100mL20%鹽酸中，混勻，置棕色瓶中，臨用新制。
3.1.6 鹽酸萘乙二胺溶液（2g/L）：稱取0.2g鹽酸萘乙二胺，溶解於100mL水中，混勻，置棕色瓶中，臨用新制。
3.2 參考物質
亞硝酸鈉參考物質中文名稱、英文名稱、CAS號、分子式、相對分子質量見表1，純度≥99%。
表1 亞硝酸鈉中文名稱、英文名稱、CAS登記號、分子式、相對分子質量
中文名稱
英文名稱
CAS登錄號
分子式
相對分子質量
亞硝酸鈉
Sodiumnitrite
7632-00-0
NaNO2
69.00
3.3 標準溶液配製
亞硝酸鈉標準工作液（200µg/mL，以亞硝酸鈉計）：精密稱取適量經110℃—120℃乾燥恆重的亞硝酸鈉參考物質（3.2），加水溶解，移入250mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，混勻。
3.4 材料
亞硝酸鹽快速檢測試劑盒：適用基質為肉及肉製品，需在陰涼、乾燥、避光條件下保存。
4 儀器和設備
4.1 移液器：200µL，1mL
4.2 渦旋混合器或超聲儀
4.3 電子天平或手持式天平：感量為0.01g和0.0001g
4.4 離心機
4.5 微孔濾膜：0.45μm（水系）
5 分析步驟
5.1 試樣製備
取適量有代表性樣品的可食部分，充分粉碎混勻。
5.2 試樣的提取
準確稱取試樣1g（精確至0.01g），置於離心管中，準確加水10mL，超聲或渦旋振蕩提取5min，靜置10min。準確吸取1mL上清液（如樣品渾濁，≥3000r/min離心5min取上清液，或經微孔濾膜過濾後取續濾液）於檢測管中，向檢測管中滴加對氨基苯磺酸溶液200μL，混勻靜置1min，再加入鹽酸萘乙二胺溶液100μL，混勻靜置5min，即得待測液。
5.3 測定步驟
將待測液與標準色階卡目視比色，10min內判讀結果。進行平行試驗，兩次測定結果應一致，即顯色結果無肉眼可辨識差異。
5.4 質控試驗
每批樣品應同時進行空白試驗和質控樣品試驗（或加標質控試驗）。用色階卡和質控試驗同時對檢測結果進行控制。
5.4.1 空白試驗
稱取空白樣品，按照5.2和5.3步驟與樣品同法操作。
5.4.2 質控樣品試驗（或加標質控試驗）
亞硝酸鹽質控樣品：採用典型樣品基質或相似樣品基質按照實際生產工藝生產的，含有一定量亞硝酸鹽，並可穩定保存的樣品。經參比方法確認的質控樣品中亞硝酸鹽含量（以亞硝酸鈉計）應包括但不限於10mg/kg。
加標質控樣品：準確稱取空白試樣1g（精確至0.01g），置於離心管中，加入適量亞硝酸鈉標準工作液（200µg/mL）（3.3）使樣品中亞硝酸鈉含量為10mg/kg。
質控樣品（或加標質控樣品）按5.2和5.3步驟與樣品同法操作。
6 結果判定要求
觀察檢測管中樣液顏色，與標準色階卡比較判讀樣品中亞硝酸鹽（以亞硝酸鈉計）的含量。顏色淺於檢出限（1mg/kg）則為陰性樣品；顏色深於10mg/kg則為陽性樣品。色階卡見圖1。
註：1.顏色接近或深於1mg/kg，但淺於或接近10mg/kg時，則考慮本底汙染或帶入所 2.10mg/kg僅作為本方法的本底控制限。
圖1 亞硝酸鹽色階卡質控試驗要求：空白試驗測定結果應為陰性，質控樣品試驗測定結果應在其標示量值允差範圍內，加標質控試驗測定結果應與加標量相符。
7 結論
由於色階卡目視判讀存在一定誤差，為儘量避免出現假陰性結果，讀數時遵循就高不就低的原則。當測定結果大於10mg/kg時，應對結果進行確證。
8 性能指標
8.1 檢測限：1mg/kg。
8.2 靈敏度：靈敏度應≥99%
8.3 特異性：特異性應≥85%。
8.4 假陰性率：假陰性率應≤1%。
8.5 假陽性率：假陽性率應≤15%。
註：性能指標計算方法見附錄A。
9 其他
本方法所述試劑、試劑盒信息及操作步驟是為給方法使用者提供方便，在使用本方法時不作限定。方法使用者在使用替代試劑、試劑盒或操作步驟前，須對其進行考察，應滿足本方法規定的各項性能指標。
本方法參比方法為GB 5009.33-2016《食品安全國家標準食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定—第二法分光光度法》。
待測樣品中若存在高含量的亞硫酸氫鈉、抗壞血酸或醬油時，會對本法的顯色結果產生一定影響，檢測時應予以注意。
色階卡應確保在試劑盒保質期內不出現褪色或變色的情況。
附錄A
快速檢測方法性能指標計算表
表A.1 性能指標計算表
樣品情況a
檢測結果b
總數
陽性
陰性
陽性c
N11
N12
N1.=N11+N12
陰性
N21
N22
N2.=N21+N22
總數
N.1=N11+N12
N.2=N21+N22
N=N1.+N2.或N.1+N.2
顯著性差異(х2)
c2=(|N12-N21|-1)2/(N12+N21),
自由度（df）=1
靈敏度(p+，%)
p+=N11/N1.
特異性(p-，%)
p-=N22/N2.
假陰性率(pf-，%)
pf-=N12/N1.=100-靈敏度
假陽性率(pf+，%)
pf+=N21/N2.=100-特異性
相對準確度，%d
(N11+N22)/(N1.+N2.)
註：
a由參比方法檢驗得到的結果或者樣品中實際的公議值結果；
b由待確認方法檢驗得到的結果。靈敏度的計算使用確認後的結果。用於確認方法時，結果≥1mg/kg時，判定為陽性（僅用於計算性能指標）；
c本方法規定：用於計算靈敏度和假陰性率的陽性樣品，由參比方法檢驗得到的結果範圍應在1—10mg/kg之間。
N：任何特定單元的結果數，第一個下標指行，第二個下標指列。例如：N11表示第一行，第一列，N1.表示所有的第一行，N.2表示所有的第二列；N12表示第一行，第二列。
d為方法的檢測結果相對準確性的結果，與一致性分析和濃度檢測趨勢情況綜合評價。
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