奧浦邁·老奧說：漫談培養基發展史（一）

細胞培養基開發半個多世紀，一代代科學家卓絕努力實現了一個個看似不可能的技術突破，期間江湖上也有許多軼事。時間軸上看培養基開發可以分三個階段：1. 1957-1997（從血清到無血清）；2. 1998-2011（從無血清到化學成分確定）；3. 2011-當下（國內生物醫藥崛起）。

緣起

小小細胞蘊藏無限能量，1957年科羅拉多大學醫學系教授Dr. Theodore T. Puck從中國倉鼠分離出卵巢細胞（Chinese Hamster Ovary，CHO），並成功進行體外連續傳代培養。60多年後，CHO細胞成功表達超過80%的上市和臨床階段蛋白和抗體藥物，廣泛用於治療癌症、感染和自免疫疾病，相關藥物年銷售超千億美金。Puck博士或不曾料到他的發現會有如此廣闊的應用和深遠的貢獻。

正如花草樹木生長需要土壤，細胞離不開培養基提供的營養和環境。雖然動物細胞體外維持培養的研究可以追溯到20世紀初甚至更早，培養基配方開發劃時代的裡程碑當屬Harry Eagle博士分別於1955年和1959年在《科學》雜誌上發表的兩篇研究文章。1955年Eagle博士發布細胞基礎培養基配方，並指出培養基是「一個包含無機鹽、胺基酸、糖、維生素及其它必須營養物的等滲透壓且具有pH緩衝能力的混合物」，說白了培養基就是「細胞營養液」。Eagle博士在1959年的文章中提出了進一步改進的配方，並將該配方命名為「Minimal Essential Medium (MEM)」。MEM配方需要在10%以上牛血清濃度下才能支持細胞生長，但在60年後的今天MEM培養基仍然被用於研究領域和一些疫苗生產工藝裡，Eagle博士的研究工作奠定了近代無血清培養基開發的基礎。

優化

血清含有上千種不同成分，為細胞體外培養提供廣泛而豐富的營養和各種細胞因子，早期的培養基公司創業都是從提供牛或者馬的血清開始的。但動物血清的使用存在引進外源病毒的風險，因此減少血清濃度甚至完全去除血清對細胞培養有著重大的意義。

1960年代無血清培養基開發可以分為兩個研究方向推進：一條路線是尋找能替代血清支持細胞在體外擴增的營養成分；另一條路線則更加重視優化配方中營養物成分和濃度實現細胞的高密度培養。需要指出血清的添加未必能提高細胞密度，科學家通過研究培養基中營養成分消耗，發現提高胺基酸和維生素的濃度可以提高細胞最高密度。

上述兩條路徑又是有交叉的，沿著兩條路徑科學家們在60-80年代間研發出許多不同系列的培養基配方，列舉一些有代表性的：

1. Dulbecco和Freeman於1959年發表了改進版的MEM配方Dulbecco’s MEM （DMEM）；

2. 1984年Iscove又在DMEM基礎上進一步改進推出了IMEM配方；

3. Moore等人1967年推出RPMI（Roswell Park Medical Institute）系列配方，RPMI在維持無機鹽濃度的前提下提高了胺基酸維生素等成分的濃度；

4. 1965年和1984年Richard Ham博士發布了F-10和F-12系列培養基；

5. Charity Waymouth博士1984年研發了MCDB系列配方。

在此，必須提到1960年代成立的幾個老牌培養基：GIBCO、HyClone和JRH：

1. GIBCO（Grand Island Biological Company），1962年由Bob和Earline Ferguson 夫婦在紐約州格蘭德島自家車庫創立細胞培養公司，早期生產用於細胞培養的血清。格蘭德島處在水牛城到尼亞加拉瀑布的路上，尼亞加拉河從邊上流過，優質的水源或許給其培養基注入了生命，後來GIBCO成為行業的標杆。1983年GIBCO與BRL（Bethesda Research Laboratories）公司合併，公司啟用新名字Life Technologies，這是LIFE最早的由來。

2. HyClone，1967年在猶他州洛根市成立，早年是基於猶他大學研究高質量胎牛血清開始，Logan距離鹽湖城開車有一個小時多點的路程。

3. JRH Biosciences，1967年在澳大利亞成立，早期也是提供血清產品，澳洲也一直是優良血清的產地，沒有去過澳洲，對JRH的歷史也沒查到太多。

除了上面三家，另外幾個小品牌如LONZA、BD、Irvine和其它一些小培養基公司，誕生的時間比較晚。

到了1980’s年代，Gordon Sato博士和同期其他科學家進一步優化配方在替代血清方面取得突破：通過在基礎培養基裡添加蛋白（如胰島素、轉鐵蛋白和白蛋白）可以在很大程度上替代血清。而後1982年Hiroki Murakami博士發現了另外一個在無血清條件下促進細胞倍增的主要成分乙醇胺，由此提出了ITES混合物作為無血清培養基的添加劑（Insulin、Transferrin、Ethanolamine和Selenium），ITES添加可以降低或者免除血清添加並實現高密度細胞培養。

突破

歷史性的突破在90年代，1991年GIBCO推出CHO-S-SFM系列無血清培養基實現了CHO細胞完全無血清培養。白蛋白的主要功能是作為微量元素的載體，進一步研究發現微量元素等可以替代白蛋白的添加；類胰島素生長因子IGF-1可以替代胰島素；改進鐵離子往細胞內轉運可以替代轉鐵蛋白。90年代中期出現了最早的無蛋白培養基（Protein-free Medium，PFM），PFM 往往還含有蛋白水解物，而通過用植物來源的水解物代替動物蛋白腖進一步降低了動物來源成分的風險。

1997年GIBCO推出的CD CHO是第一個完全化學成分確定的培養基（Chemically-defined Medium，CDM），在那個水解物廣泛採用的時代，CD CHO是個培養基開發歷史上的裡程碑，培養基開發從此進入一個全新的時代。

與此同時，GIBCO的命運也發生了重大轉折。那個時候，Life Technologies在紐約證交所歷史最久的上市公司Dexter Corporation的下面，Dexter是家族企業，可以溯源到美國獨立戰爭前，最早是從事鋸木廠業務的。1999-2000年上市剛剛一年的加州公司Invitrogen以$19億美金現金加股票的方式收購了Life Technologies，LIFE也因此消失於行業視野直到2009年。

後記

在GIBCO推出CD CHO的那年夏天，老奧用在研究院兩年掙來的幾百塊工資買了套西裝，回到魔都梅隴路上的大學，終於讀上了心儀的生物化工專業研究生。導師張元興教授給了個研究課題：「CHO細胞無血清培養基開發生產促紅細胞生成素（rhEPO）」，從此與培養基結緣至今。