女性歷史記錄年｜兩位女科學家因基因編輯獲化學諾獎

法國科學家Emmanuelle Charpentier與美國科學家Jennifer Doudna

-編者按-

五分鐘前，瑞典皇家科學院宣布，2020年諾貝爾化學獎授予加州大學詹妮弗·杜德納（ Jennifer Doudna） 和現在德國工作的法國科學家Emmanuelle Charpentier，表彰她們發明基因修飾方法CRISPR-Cas9。這一工作由來已久，最後技術突破是2012年Jennifer Doudna和Emmanuelle Charpentier。但在她們之前和之後，有多位科學家的貢獻，所以一直不清楚她們之外，還有誰會與她們共享。

北京時間2020年10月7日下午，諾貝爾獎委員會做出了選擇：加州大學伯克利分校教授詹妮弗·杜德納和德國馬普感染生物學研究所教授埃馬紐爾·夏彭蒂耶因「研發出一種基因組編輯方法」獲得2020年諾貝爾化學獎。

華人科學家張鋒被認為是諾貝爾獎的熱門人選。

CRISPR是 Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats（成簇規律間隔短回文重複序列）這一短語的首字母縮寫，是基因組DNA上的一段特殊的序列，源於細菌及古細菌中一種獲得性免疫系統，能夠識別出入侵細菌的病毒，並通過一種特殊的酶破壞入侵的病毒。

實際上，人們第一次發現CRISPR序列是在1987年，由日本分子生物學家石野良純（Yoshizumi Ishino）在大腸桿菌中偶然發現，但是第一次證明CRISPR/Cas9可以進行基因編輯，是美國分子生物學家杜德納和瑞典于默奧微生物研究中心的法國微生物學家夏彭蒂耶在《科學》雜誌發表的第一篇研究論文。在2012年6月發表的論文中，兩位女性科學家帶領的研究團隊純化了Cas9蛋白，發現它是雙RNA引導的DNA內切酶，首次在體外證明使用Cas9的CRISPR系統可以切割任意DNA鏈，指出CRISPR在活細胞中修改基因的能力。這是最早發表的把細菌天然免疫系統演變成CRISPR/Cas9基因編輯工具的工作。 因為簡單、廉價和高效，CRISPR已經成為全球最為流行的基因編輯技術，被稱為編輯基因的「魔剪」。科學家通過它可以高效、精確地改變、編輯或替換植物、動物甚至是人類身上的基因，經過改造的CRISPR技術被廣泛地應用於農業和生物醫藥領域。

瑪麗亞·賈辛的貢獻

瑪麗亞·賈辛（Maria Jasin）於1984年在麻省理工學院獲得了博士學位，師從Paul Schimmel教授。之後分別在蘇黎世大學和史丹福大學進行博士後研究。結束博士後訓練後，她在紀念斯隆-凱特琳癌症中心建立了自己的實驗室。

賈辛的研究從一種叫做DNA同源重組的細胞生命活動開始。由於細胞內的DNA經常受到損傷，特別是雙鏈發生斷裂時，如果不能很好地修復會對細胞造成致命的影響。細胞內有一套機制，能讓受傷的DNA以與其同源的序列（一般來源於其等位基因，也就是從雙親中的另一方繼承的相同的基因）為模板來自我修復，這個過程即稱為同源重組。

1990年代後期，賈辛的實驗室發現兩個基因BRAC1和BRAC2的突變和乳腺癌以及卵巢癌有很強的相關性。經過研究，他們發現這兩個基因參與DNA同源重組介導的DNA修復。這些發現不僅大大加深了人們對DNA修復機制的理解，而且具有極大的臨床價值。例如，在此基礎上，科學家發現一類小分子，能抑制PARP通路，目前已廣泛用於BRCA基因突變導致的腫瘤的治療。

在研究同源重組的過程中，賈辛使用了一種內切酶（I-SceI）來產生DNA斷裂。在一種小鼠細胞中導入了這個酶以後，賈辛發現細胞基因組發生了改變。她敏銳地意識到，這個過程可以用來在活體細胞中改變基因，也就是我們現在所說的基因編輯。1994年，她將這個發現寫成論文投稿，然而卻接連被四五家頂級雜誌拒稿。《科學》雜誌甚至沒有將手稿送審。賈辛後來回憶道：「因為那個時候沒人對這種類型的DNA修復感興趣」。幸運的是，最終這篇文章被《分子細胞生物學》雜誌接受，成為了基因編輯領域的奠基之作。

賈辛的工作為後來的基因編輯提供了以同源重組修復的方式進行的理論基礎。但受限於當時的知識，賈辛未能找到在基因組特定位點導入雙鏈斷裂的方法。直到2003年，戴納·卡羅爾（Dana Carroll）等人利用鋅指蛋白解決了在特定位點引入雙鏈斷裂的問題，哺乳動物細胞的基因編輯才真正成為可以實現的技術。今天，CRISPR技術已經使基因編輯變得非常容易，但我們不應忘記，正是賈辛早期的工作使基因編輯成為可能。

CRISPR專利之爭

最早證明CRISPR-Cas9可以編輯哺乳動物細胞基因的華人科學家、麻省理工學院教授、博德研究所資深研究員張鋒（Feng Zhang）和哈佛大學醫學院教授喬治·徹奇（George Church）無緣此次諾貝爾獎。

在此之前，1993年諾獎得主、麻省理工學院教授菲利普·夏普（Phillip Sharp）曾表示，基於CRISPR的基因編輯技術有四個關鍵的發現者：夏彭蒂耶、徹奇、杜德納和張鋒。所以，諾獎最多頒給三人的規則顯然就是個問題。他認為，一個比較明智的決定可能是：諾貝爾化學獎頒給杜德納和夏彭蒂耶，她們的工作是純生化，生理或醫學獎給徹奇和張鋒，他們在活體細胞中成功應用CRISPR，為醫學的應用鋪平了道路。

雖然張鋒與此次諾獎無緣，但他和博德研究所在美國擁有CRISPR/Cas9技術應用於所有真核生物——包括植物、動物和人類——的專利，這是CRISPR技術商業化最為核心的專利之一。 2013年1月，張鋒和徹奇同時在《科學》雜誌分別發表論文，將CRISPR/Cas9基因編輯技術成功地運用到小鼠和人類細胞，實現了CRISPR在哺乳動物細胞的基因編輯。而在幾周之後，杜德納實驗室也發表了類似的結果。 憑藉證明自己的實驗室在2011年就開始有了把Cas蛋白簇和tracrRNA放到哺乳動物細胞中的想法，並第一個證明CRISPR/Cas9整個概念，使CRISPR技術從最初的構想到在哺乳動物細胞成功應用的證據，張鋒在2014年4月獲得美國專利與商標局關於CRISPR的首個專利授權。 對於這一結果，更早提交專利申請的杜德納和加州大學伯克利分校並不認可，並在2015年4月提交申訴材料。2016年1月，關於誰首先發明了CRISPR技術，加州大學伯克利分校和麻省理工學院-哈佛大學博德研究所展開交鋒。杜德納和加州大學伯克利分校認為，張鋒只是杜德納論文的諸多跟進者之一，將CRISPR運用到小鼠和人類細胞上只需要常規技術。但張鋒一方的理由是：杜德納只是預測CRISPR會在人類細胞上有效，自己是第一個將CRISPR運用到人類細胞中的人。隨後，美國專利與商標局宣布正式啟動幹涉程序，將重新宣判CRISPR專利的歸屬問題。 2017年2月，三名專利法官組成的小組一致裁決，張鋒等人2014年申請的專利「在事實上毫無爭議」，與加州大學伯克利分校申請的專利並無衝突。根據這一裁定，杜德納和加州大學伯克利分校覆蓋關於CRISPR的所有專利，而張鋒和博德研究所擁有其中的一項關鍵專利。

不過，加州大學伯克利分校在接受媒體採訪時表示尊重專利法庭的裁決，但還是將會上訴至美國聯邦巡迴上訴法院。

2018年9月10日，美國聯邦法院的裁決支持了專利上訴委員會2017年2月對基因編輯技術CRISPR專利的決定。專利上訴委員會認為，博德研究所擁有的CRISPR專利，並未侵犯伯克利以及維也納大學的利益。CRISPR基因編輯技術背後的科學家事實上，CRISPR技術今天能夠給整個科學界和農業、生物醫藥領域帶來暴風驟雨般的變革，其發現離不開一大批科學家和博士研究生的貢獻。 博德研究所所長埃裡克·蘭德（Eric Lander）曾經就CRISPR基因編輯技術的發明過程總結了一篇「CRISPR英雄譜」： 1993年，西班牙科學家弗朗西斯科·莫伊卡（Francisco Mojica）首先在嗜鹽古細菌（Haloferax mediterranei）的基因組中發現了大約30個鹼基對（bp）長度的回文重複序列，這些序列由36bp的間隔序列隔開。

2005年，經過生物信息學序列比對方法，莫伊卡發現，CRISPR序列中三分之二的間隔序列為病毒或外源質粒的序列，他意識到CRISPR系統與細菌的獲得性免疫有關。

與此同時，法國科學家吉利斯·維格諾德（Gilles Vergnaud）和俄國科學家亞歷山大·博洛廷（Alexander Bolotin）在2005年分別獨立得到與莫伊卡類似的結論，即CRISPR與細菌的獲得性免疫有關。

2007年，法國分子生物學家、杜邦公司職員菲利普·霍瓦特（Philippe Horvath）和他的同事魯道夫·巴蘭右（Rodolphe Barrangou）以及微生物學家Sylvain Moineau在研究生產酸奶的乳酸桿菌對噬菌體的抗性時，發現了Cas7和 Cas9蛋白在CRISPR中的作用：Cas7產生間隔和重複序列，Cas9則是核酸酶。

2008年8月，荷蘭科學家範德歐斯特（John van der Oost）通過生物化學方法鑑定了一系列Cas蛋白，並發現這些蛋白需要切割一段長為61鹼基的前體RNA（crRNA）才能工作。他們證明了crRNA的作用，並通過人為設計相應的crRNA序列使菌株獲得了抵抗噬菌體的特性。這是人類首次編輯CRISPR系統。

2008年12月， 阿根廷科學家盧西亞諾·馬拉夫尼（Luciano Marraffini）和他的導師埃裡克·松特海姆（Erik Sontheimer）證實了CRISPR系統的底物是DNA，並且意識到該系統可能可用於DNA編輯。

2010年12月，西爾萬·莫伊諾（Sylvain Moineau）證實了核酸酶Cas9可以在crRNA的指導下對特定序列的DNA進行切割。 2011年7月，立陶宛科學家維吉尼亞斯·斯克斯尼斯（Virginijus Siksnys）在大腸桿菌中重組了嗜熱鏈球菌的CRISPR系統，證實了該系統至少需要Cas9核酸酶，crRNA和tracrRNA三個組分，這一結果2012年9月發表於《美國國家科學院刊》（PNAS）。

2012年8月，杜德納和夏彭蒂耶發表關鍵性的實驗，揭示CRISRP/Cas9技術可以實現基因編輯的分子機制。

不過，蘭德的這篇文章被認為將榮譽歸實驗室的領導者，而忽視了博士後和研究生的貢獻。

《自然》新聞曾經寫過一篇文章，詳細介紹了在開發CRISPR/Cas9技術的過程中，杜德納實驗室的博士後布萊克·威登赫夫特（Blake Wiedenheft）和馬丁·伊內克（Martin Jinek），張鋒實驗室的叢樂，徹奇實驗室的博士研究生楊璐菡，立陶宛維爾紐斯大學維吉尼亞斯·斯克斯尼斯團隊的博士研究生基迪斯·加西烏納斯（Giedrius Gasiunas）等做出的貢獻。

那些年，CRISPR研究帶來的榮譽「近期很少有一個發現能夠像CRISPR在生物領域一樣，改變整個領域的研究。它在人類健康與疾病等方面有極大的應用潛力。」2018年8月，美國阿爾伯尼生物醫學獎委員會主席Vincent Verdile博士曾這樣說。

實際上，在諾貝爾獎頒給CRISPR之前，CRISPR早已得到眾多獎項的認可，為相關的研究者帶來大量的榮譽。

2014年，杜德納與夏彭蒂耶共同分享了2015年生命科學突破獎，每人獲得300萬美元的獎金。

2015年，杜德納與夏彭蒂耶獲得西班牙的阿斯圖裡亞斯女親王獎（Premios Princesa de Asturias）中的科學技術獎項。

2016年3月9日，杜德納、夏彭蒂耶、魯道夫·巴蘭右、菲利普·霍瓦特和維吉尼亞斯·斯克斯尼斯因在理解CRISPR的細菌防禦系統及其在基因編輯方面的革命性發現做出傑出貢獻獲得2016年度阿爾珀特獎。

2016年3月23日，杜德納、夏彭蒂耶與張鋒「因將基因編輯技術CRISPR-Cas應用於真核細胞所作出的努力」獲得有「小諾貝爾獎」之稱的加拿大蓋爾德納國際獎（Gairdner International Award）。

2016年6月19日，臺灣唐獎的生技醫藥獎再次頒給以上三人，以表彰他們為「發展CRISPR-Cas9系統成為突破性的基因編輯平臺」做出的貢獻。

2017年2月2日，杜德納與夏彭蒂耶獲得2017年日本獎（Japan Prize），每人獲得5000萬日元（約42萬美元）的獎金。

2018年5月31日，杜德納、夏彭蒂耶和斯克斯尼斯獲得卡弗裡納米科學獎。

杜德納關於發現CRISPR/Cas9實現基因編輯的回顧：在與夏彭蒂耶、張鋒一起獲頒臺灣唐獎的一個報告中，杜德納回顧了她和夏彭蒂耶是如何發現CRISPR/Cas9可以實現基因編輯的。 我們和夏彭蒂耶合作，用生物化學方法純化了 Cas9 蛋白，發現它是雙 RNA 引導的 DNA 內切酶，意思是這個蛋白能夠和兩條不同的 RNA 結合。一條是包含引導序列的 crRNA，能和DNA進行鹼基配對。

在合作的過程中我們發現，另一條 tracrRNA 對於 crRNA 的加工處理很重要，對於尋找目標 DNA 的能力也是必要的，所以這是一個兩條 RNA 的系統在和蛋白交互作用，形成進行監控的複合體。這個蛋白的運作方式是靠兩把化學剪刀，在目標區域將 DNA 旋開後進行切割。重要的是，要切割的目標位置，必須是在 DNA 上的 PAM 模體旁邊。

在了解運作的機制之後，我們意識到其實可以把系統進一步簡化，弄得比自然界更為簡單。我們將兩條 RNA 合而為一，形成單鏈引導型態：一端包含需要搜尋的目標序列，另一段是和 Cas9 結合所需要的資訊。如此簡化成雙分子系統，一個蛋白被一條 RNA 引導至 DNA 序列，製造DNA 的雙股斷裂。

如果要鎖定新的目標，只要變更RNA 這一小段序列，任何分生學家都可以輕易在實驗室內辦到。我們為此感到很興奮，因為我們了解到這顯然是可以程式化的蛋白。設定指令即可導向不同的DNA序列，進行雙股切割。