撰文 | Qi
責編 | 兮
阿爾茲海默症（Alzheimer's Disease,AD）是最常見的一種以患者的記憶力減退，認知能力障礙，情緒調節異常等為特徵的神經退行性疾病。伴隨人口壽命的增長，這類嚴重威脅中老年生命質量的疾病發病率也與日俱增，然而截至目前，對其發病機制的各種解釋呈百家爭鳴的局勢。其中最為普遍被人們接受的是澱粉樣蛋白假說（The amyloid hypothesis），澱粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein,APP）作為這一假說的核心，其被β-與γ-分泌酶切割生成的β-澱粉樣蛋白（amyloid-β，Aβ）長期以來被認為是導致AD相關病理損傷的始作俑者。因此，從根本上解決Aβ的產生機制問題對於開發針對於AD有效的治療手段顯得尤為重要。
2018年11月29日，美國桑福德·伯納姆·普雷比醫學發現研究所（Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute）的Jerold chun與Tao Long研究組（下文統一簡寫為Lee等）在Nature上合作發表題為「Somatic APP gene recombination in Alzheimer’s disease and normal neurons」的文章【1】。該研究成果曾被置於Science官網頭版頭條報導，並被評價為點燃阿爾茲海默症的「裡程碑式的發現」。
文章中，Lee等通過對散發性阿爾茲海默症（sporadic Alzheimer's Disease,SAD）患者和健康個體的大腦分選出的神經元細胞核進行研究，提出大腦神經元中的APP基因存在不同於野生型基因座的形式，而是以不計其數的變異「基因組cDNA」（genomic cDNA,gencDNA）的形式通過「鑲嵌」模式插入到基因組當中。隨後，作者們在中國倉鼠卵巢（CHO）細胞系中模擬APP gencDNA生成，通過H2O2刺激和核苷逆轉錄酶抑制劑（RTi）處理，提出gencDNA形成的必要條件：即DNA斷裂和逆轉錄酶活性。接下來，在AD的J20小鼠模型中藉助用於鑑定人APP gencDNA的DNA原位雜交（DNA in situ hybridization,DISH）探針也在2.3年觀察期間內檢測到與年齡相關的gencDNA增長。
該研究認為，基於gencDNA內含子缺失，外顯子間經由外顯子內接頭（intra-exon junctions,IEJs）連接，鹼基插入、缺失或單核苷酸變異（single-nucleotide variants,SNVs）等序列特徵，以及對轉、DNA斷裂、逆轉錄酶活性的要求，gencDNA可能產生於神經元內RNA發生的「逆轉錄-插入」事件（retroinsertion）誘發的體細胞基因重組（somatic gene recombination,SGR）。值得注意的是，截至當時尚未有任何關於特定基因可能發生體細胞基因重組研究的報導。
圖一，工作模式圖
那麼，APP gencDNA是否能被轉錄及翻譯成為具有生物活性的產物呢？研究人員在體外構建分別包含三種APP gencDNA變體的質粒，在SH-SY5Y細胞系中過表達並檢測其細胞毒性，結果顯示三種APP gencDNA變體中的兩個能明顯降低SH-SY5Y細胞的存活率。由此我們可以得知，並非所有類型的gencDNAs都能產生致病性影響，正如研究中所提到的在健康個體大腦的神經元中也能檢測到多種gencDNA的存在，不過種類和豐度相較於SAD個體而言均有3-5倍的降低。
總體而言，這項研究提供了特定基因（本文中為APP）可以發生體細胞基因重組的新思路。健康及患病個體大腦中APP gencDNAs的存在可能與神經元正常生理功能及阿爾茲海默症的發病機制都具有相關性，這一發現能否解釋以往針對Aβ的臨床治療方案失敗的原因，還需要進一步的研究來驗證。
出乎意料的是，2020年8月19日，來自波士頓兒童醫院的Christopher A. Walsh與Eunjung Alice Lee研究組（下文統一簡寫為Kim等）對該文章的結論提出質疑，並在Nature上發表題為「APP gene copy number changes reflect exogenous contamination」的文章【2】，指出Lee等檢測出的APP gencDNA是外源汙染的假象，並非真正的來自於內源APP的體細胞基因組整合。
首先，Kim等研究人員對Lee等的原始APP靶向測序數據進行分析，雖檢測到了APP基因的IEJs，卻未能檢測到跨APP和目標插入位點的任何讀段；取而代之的是，在APP編碼序列的兩端檢測到多個含pGEM-T Easy Vector多克隆位點的剪接片段，並且在Lee等所在實驗室的一項關於小鼠腦內體細胞拷貝數變異的研究中，在小鼠單神經元全基因組測序（single-cell whole-genome sequencing ,scWGS）數據集中觀察到同一人源APP pGEM-T Easy Vector以及另一攜帶APP插入序列的質粒骨架序列（pTripIEx2）汙染的情況，指出該實驗室存在多種類型的重組載體反覆汙染的情況。
隨後，從Lee研究中的SureSelect雜交捕獲測序數據中，通過計算包含載體骨架序列的剪接片段佔APP編碼序列兩端的總讀取深度的分數以表示載體汙染的水平，而每個APP外顯子連接處檢測的剪接片段的分數，表示APP gencDNA的總量（APP逆轉錄拷貝或載體插入片段）。編碼序列末端包含載體骨架的分數為1.2％，與外顯子連接處1.3％的分數相當，因而Kim等認為載體汙染是所有外顯子連接處剪接片段的主要來源。此外，Kim等認為即使囊括這些源自載體的讀段在內，所有分數都遠低於Lee研究中DISH實驗結果給出的16.5％gencDNA的保守估計。
接下來，他們在Lee等最新的以6名AD患者和1名對照個體大腦生成的全外顯子測序（whole-exome sequencing,WES）數據中發現APP巢式PCR（nested PCR）產物，即WES中支持APP gencDNA的讀段與原始Lee研究中使用的巢式PCR引物的目標位點對齊。不僅如此，他們在Park等人【3】的一項展示AD患者腦樣本的深度WES數據集的獨立研究中，發現全基因組人類和小鼠mRNA汙染的證據，且主要存在於WES數據集中報告支持APP gencDNA的讀段。Kim等研究人員認為，即使在採用高質量控制標準的情況下，二代測序實驗中仍普遍存在外源性汙染，並強調需要進行嚴格的數據分析以減輕這些重要偽像的來源。
進一步的，Kim等為了驗證Lee研究中的IEJs可能是汙染的PCR擴增產生的PCR偽像（artefact）的猜想，他們使用攜帶兩種不同APP亞型（APP-751，APP-695）的重組載體，以及報導的PCR引物與三種不同的PCR酶重複了RT-PCR和PCR分析。結果顯示，在APP插入片段和PCR酶的所有組合下，均明顯觀察到與原始APP插入片段相比大小各異的嵌合擴增條帶，進一步的通過測序確認它們的確包含APP插入片段的許多IEJs。而Lee研究中先前鑑定的17個IEJs中有12個同樣出現在這次測序結果中，因此認為先前鑑定的APP gencDNA均可能是來自外源汙染的PCR偽像。
最後，為了獨立研究是否真實存在潛在的APP gencDNA，Kim等研究人員在來自64個AD和119個對照個體神經元scWGS數據中檢索體細胞APP gencDNA。如果存在逆轉錄基因插入，則應該能觀察到明顯的序列特徵：外顯子讀取深度的增加，外顯子連接處的讀段剪接，3'UTR末端的poly-A尾巴，和跨外顯子的不一致讀對，然而卻沒有發現任何APP gencDNA存在的證據。
根據這些結果，Kim等研究人員認為Lee等報導的APP gencDNA似乎可以歸因於各種類型的外源性汙染，尤其是APP重組載體，PCR產物和全基因組mRNA汙染。他們希望Lee等有必要提供明確的證據，例如支持新的APP插入微點的讀段，排除汙染因素等，以證明在神經元中APP基因確實能夠發生體細胞基因重組現象。
在同期Nature上，針對他們提出的質疑，Lee等作出如下回應【4】。
1）體細胞基因重組的可預測結果是產生不同於野生型基因座的新型逆轉錄轉座插入位點，先前研究中已經DISH證實；且由雷射捕獲的人海馬或血液中DNA的全外顯子組下拉產生的獨立發表的數據集的分析顯示，在八條不同的染色體中鑑定出十個不同的APP插入位點。Lee等表示目前還未能察覺可能產生這些結果的汙染源，這些結果與DISH數據所顯示的APP gencDNA的位置與野生型APP不同完全一致，且這些新的APP gencDNA插入位點強烈支持APP gencDNA的自然發生。
圖二，鑑定人類基因組中新的APP插入位點
圖三，雙探針DISH顯示gencDNA與野生型基因座定位
2）Lee等認為Kim等在個別數據集中發現的外源載體汙染（pGEM-T Easy APP）並不能確切的解釋所有的APP IEJs。對另外三個包含APP gencDNA讀段的數據集進行信息分析，已經VecScreen和Vecuum script【5】排除可能的質粒汙染。
3）針對Kim等提出在Park等的AD患者腦樣本的深度WES數據集中存在全基因組人類和小鼠mRNA汙染的問題，Lee等表示mRNA逆轉錄為cDNA這一過程需要逆轉錄酶活性，然而在Park等人使用的Agilent SureSelect靶向序列捕獲技術中並未涉及逆轉錄酶，因而不能以全基因組mRNA汙染來否認APP gencDNA的存在。
4）針對Kim使用含不同亞型APP的質粒進行PCR產生包含IEJs的序列，這種非生物性的方法與Lee等鑑定生物性質的IEJs的方式之間主要存在以下幾點差異：a，除了使用相同引物序列外，實驗條件有所不同：Kim等人使用兩倍濃度的引物和超過一百萬倍濃度的模板；b，Lee等利用單分子實時測序（single molecule real-time sequencing,SMRT-seq）鑑定gencDNAs和IEJs序列時僅使用30個PCR循環即可檢測到，而Kim等則運行40個PCR循環；c，Lee等僅鑑定出了來自AD個體的大腦的45個獨特IEJs和來自健康個體大腦的20個（有重疊部分，少於65個），而Kim等鑑定出12426個（約200倍）。
5）值得注意的是，Kim等提出的「外源汙染」觀點無法解釋疾病狀態下APP gencDNA形式和豐度的顯著變化，且這種變化在比較細胞類型時也很明顯，即當同一SAD個體的大腦樣本中不同細胞類型由DISH同時處理時，信號在神經元中比在非神經元細胞中更為普遍。至關重要的是，SMRT-seq僅在SAD個體樣本中鑑定出在家族性AD中被認為是致病性的單核苷酸變異，然而攜帶這種變異的質粒並不存在於該實驗可能涉及的任何一個環節。
6） Lee等認為Kim將SureSelect雜交捕獲測序數據與DISH的APP gencDNA拷貝數估計放在一起比較完全沒有意義，因為兩種方法根本不同。首先是雜交介質的不同（前者為液相，後者為固相），其次為靶向序列的差異（前者靶向野生型基因座和gencDNA，後者僅靶向gencDNA）。
7）Kim等通過檢索自己的scWGS數據得出的APP gencDNA的陰性結果，這並不能反駁APP gencDNA的存在。Kim等自認「基因組擴增不均」，導致約20％的單細胞基因組覆蓋深度不足10x，並且在一個等位基因（~9％等位基因缺失率）或兩個等位基因（~2.3％基因座缺失率）處均可能出現擴增失敗。該失誤率很可能會錯過這些小至約0.15 kb的APP gencDNA。
綜上討論，Lee等認為支持體細胞基因重組和APP gencDNA的數據以及結論仍是完整的，因此有必要在健康及AD大腦中對APP gencDNA的產生機制和病生功能繼續進行研究。有趣的是，gencDNA對逆轉錄酶活性的依賴性，可能與65歲以上且接受長期聯合抗逆轉錄病毒療法（cART，其中包括逆轉錄酶抑制劑）的HIV感染者中極其少見罹患AD的情況相關【6,7】。如果得到證實。gencDNA及其產物可能能夠解釋AD發病機制，並有助於推動新治療策略的發展。
製版人：MENG
參考文獻
1, Lee, M. H. et al. Somatic APP gene recombination in Alzheimer’s disease and normal neurons.Nature563, 639–645 (2018).
2, APP gene copy number changes reflect exogenous contamination
3, Park, J. S. et al. Brain somatic mutations observed in Alzheimer’s disease associated with aging and dysregulation of tau phosphorylation.Nat. Commun. 10, 3090 (2019). 4, Reply to: APP gene copy number changes reflect exogenous contamination
5, Kim, J. et al. Vecuum: identification and filtration of false somatic variants caused by recombinant vector contamination.Bioinformatics32, 3072–3080 (2016).
6, Turner, R. S. et al. An individual with human immunodefciency virus, dementia, and central nervous system amyloid deposition.Alzheimers Dement.(Amst.) 4,1–5 (2016).
7, Centers for Disease Control and Prevention.HIV Surveillance Report,2016 Vol. 28 (2017)