原創 王沛 山中麻署
前言
脊髓背角神經元與中樞神經系統（CNS）小膠質細胞間的相互作用，是誘發和維持周圍神經損傷後神經病理性疼痛的重要因素。最新研究表明，外周神經損傷在激活背角小膠質細胞的同時，同側背根神經節（DRG）中的巨噬細胞數量也會顯著增加，提示DRG中也存在前痛覺神經元和非神經元細胞間的相互作用。然而，目前尚不清楚DRG中巨噬細胞的增加在神經損傷所誘導的疼痛表型中的作用。
巨噬細胞Fas誘導凋亡（MAFIA）轉基因小鼠在CSF1R啟動子的調控下表達一個自殺基因（Fas），該基因在巨噬細胞和小膠質細胞中特異表達，用FK結合蛋白二聚體AP20187（AP）可以激發巨噬細胞的凋亡。AP在MAFIA小鼠中不能透過血腦屏障，因而這種方法可以選擇性地殺傷巨噬細胞。並且由於該品系小鼠在同一啟動子的調控下共同表達綠色螢光蛋白（GFP），因此可以檢測表達Fas的細胞的分布及其消耗程度。
Shepherd等人用MAFIA小鼠證明，清除神經損傷部位來自循環血中的單核/巨噬細胞後，可以減少神經病理性疼痛的發生。但由於該研究中DRG中的巨噬細胞並沒有被清除，所以研究者認為，是外周巨噬細胞而不是DRG中的巨噬細胞在神經損傷引起的神經病理性疼痛中扮演重要角色。然而，既往已有研究證明在保留DRG巨噬細胞的同時，外周血單核/巨噬細胞的選擇性耗竭對神經性疼痛的發展影響有限。鑑於此矛盾結果，作者再次使用MAFIA小鼠探究該問題，通過在外周神經損傷前或損傷後給予AP，觀察DRG巨噬細胞對機械性超敏反應的發生和持續的作用。
1、神經損傷導致DRG中巨噬細胞擴增
作者標記了CX3CR1（外周單核細胞和小膠質細胞的特異性標記），利用FACS分析保留性神經損傷（SNI）模型小鼠DRG內巨噬細胞。結果顯示，在神經損傷後第4天（POD4），L4和L5損傷同側的DRG中CX3CR1+細胞數量較對側增加了2.9±0.4倍，且該現象至少持續了4周（POD28）（圖1A）。
作者進一步追溯擴增的巨噬細胞來源。FACS分析顯示，POD1時同側DRG中Ki67+/CX3CR1+巨噬細胞的百分比與對側沒有差異。然而在POD4，損傷同側DRG中Ki67+/CX3CR1+巨噬細胞的百分比增加了一倍以上（圖1B和圖2A，B）。FACS分析顯示小膠質細胞(Ki67+CX3CR1+)在POD4腰段上較同側神經損傷比對側增殖增加了2倍多(圖2C)。故軸突損傷誘導的DRG巨噬細胞擴增機制涉及局部增殖，儘管不能排除浸潤的可能性，但作者更傾向於認為這種擴增以常駐巨噬細胞的增殖為主。
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2、AP全身給藥可使DRG巨噬細胞耗竭
使用MAFIA轉基因小鼠，連續3天腹腔注射AP（1.0 mg/kg）。使用GFP和PU.1（骨髓單核細胞及其未成熟細胞中表達的轉錄因子）共同標記DRG中的巨噬細胞。三次注射後，GFP+/PU.1+細胞和GFP+/Iba1+細胞顯著減少（圖1C）。在另一組小鼠中，在3天AP方案後的第1天，FACS分析顯示，L4和L5 DRG中的常駐（GFP+）巨噬細胞減少約80%（圖1D）。同時，FACS分析顯示，循環成熟單核細胞減少近90%（圖2C）。在D6血液中單核細胞的百分比基本恢復基線值，儘管體重持續下降（圖3F）。綜上所述，MAFIA小鼠經AP處理後，DRG內的常駐巨噬細胞以及外周單核細胞（儘管是短暫）顯著降低，但並不改變疼痛閾值。
建立神經損傷模型。通過qPCR檢測DRG中Cx3cr1的表達以了解巨噬細胞的早期反應。實驗記錄到，與未受傷側DRG相比，造模側L4/L5 DRG中的Cx3cr1表達增加了2.1±0.4倍。在SNI之前，AP處理不僅降低了未受傷側DRG中的基線Cx3cr1表達，而且還阻止了造模側DRG中Cx3cr1表達的增加（圖1G）。到POD4（最後一次AP治療後第5天），巨噬細胞數量恢復到未受傷、對照組小鼠中記錄的水平(圖1E)。到POD9時，同側DRG中巨噬細胞擴增再次出現，與未用AP的對照組沒有差異（圖1F）。
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3、AP方案不改變脊髓內小膠質細胞數量
這部分研究是為了確認AP不能通過BBB。與未受傷的對照組小鼠相比，作者通過FACS發現AP處理的小鼠脊髓中小膠質細胞數量沒有差異，小膠質細胞的免疫染色結果也沒有差異。該結果明確了AP的外周選擇性作用。作者還討論了神經損傷後BBB受損可能導致AP漏入脊髓的可能性。神經損傷導致的Cx3cr1基因表達上調、小膠質細胞激活、SNI後1天和4天小膠質細胞增生的現象在AP組和對照組的脊髓中均沒有不同。總之，AP給藥對脊髓小膠質細胞和星形膠質細胞都沒有影響。
4、DRG巨噬細胞是神經損傷誘導的機械性痛覺超敏的必要條件
使用SNI模型，對照組小鼠在造模後24小時內發生機械性超敏反應，3天AP治療方案顯著延遲了超敏反應的發生，至少延遲至神經損傷後的第7天（圖1）。如果維持巨噬細胞的量，則小鼠表現出機械痛超敏。此外，SNI後持續使用AP並不能進一步加強其抗超敏效應（圖2）。研究結果表明，AP治療的抗痛覺超敏作用與預防DRG巨噬細胞擴增有關，且這種影響與體重減輕無關（圖3）。
在另一個實驗中，作者將從MAFIA小鼠中分離的骨髓祖細胞（GFP+）移植到經輻射的WT小鼠中，脊髓中的小膠質細胞主要來源於宿主。SNI模型證實了AP對脊髓小膠質細胞沒有作用，且DRG中AP介導的巨噬細胞耗竭顯著延遲了神經損傷引起的機械性超敏反應的發展（圖4）。
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5、神經性疼痛表型的發生需要DRG中巨噬細胞擴增，
並且與神經損傷部位的巨噬細胞浸潤無關
作者設計實驗以選擇性地耗竭損傷部位的巨噬細胞，使DRG巨噬細胞保持完整。作者在神經損傷部位植入套管，通過套管給予低劑量AP，從而選擇性地針對損傷部位周圍的巨噬細胞而沒有全身作用。在神經損傷之前，作者通過套管給予小劑量AP（0.8μg/20μl，連續3天給藥）。在給藥後第1天，通過量化GFP+細胞密度，作者發現AP處理的小鼠神經損傷部位的巨噬細胞（GFP+）與對照組相比減少了近90%。這種給藥途徑並不能阻止受損DRG中巨噬細胞的擴增，對機械性超敏反應的發生也沒有影響。我們的發現不同於先前的報導，巨噬細胞在DRG而不是損傷部位的擴增，是引起神經損傷的機械性超敏反應所必需的。
6、DRG中的巨噬細胞促進神經損傷所致機械性痛覺異常的維持
SNI誘導的機械性痛覺異常持續時間長，這種行為表型與同側背角小膠質細胞的長時間激活有關。周圍神經損傷後，小膠質細胞的激活至少持續4周。在這個時間點，我們還記錄到同側DRG和神經損傷部位的巨噬細胞數量持續增加（圖1）。
圖1
為了研究外周巨噬細胞對維持機械性超敏反應的作用，作者在神經損傷後28天（POD28）重複了三天AP方案。使用量化GFP+/PU.1+巨噬細胞密度（單位面積細胞數），以及Cx3cr1的qPCR的方法進行研究，與對照組相比，DRG巨噬細胞減少了近50%（圖2a,b）。在另一組接受類似治療的小鼠中，研究發現機械性痛覺過敏短暫性的緩解了80%（圖2c）。在最後一次注射AP後6天內，痛覺過敏再次出現。為了研究損傷部位的巨噬細胞是否有助於維持持續性機械性超敏反應，作者在SNI4周後植入套管，並連續3天每天給藥0.8ug AP。圖4d顯示神經損傷部位巨噬細胞的選擇性耗竭對持續性機械性超敏反應沒有影響。故DRG中的巨噬細胞，而不是周圍神經損傷部位的巨噬細胞，是維持周圍神經損傷引起的超敏反應的關鍵因素。
圖2
7、神經損傷引起DRG巨噬細胞與感覺神經元間的相互作用
在AP處理的小鼠中，巨噬細胞的耗竭並不能阻止CSF1在感覺神經元中的表達。由於DRG巨噬細胞表達CSF1R，損傷誘導的CSF1表達是否有助於DRG巨噬細胞的擴增。
使用Adv-Cre；Csf1fl/f1小鼠中進行了研究（選擇性地從感覺神經元中敲除Csf1基因，防止了神經損傷引起的Csf1表達和機械性超敏反應的發生）。與預期一樣， POD4時轉基因小時腰椎背角的小膠質細胞的激活和增殖基本被消除（圖1a）。有趣的是，Csf1的條件性缺失也阻止了DRG中巨噬細胞的損傷性擴增（圖1b）。在整體缺乏CCL2（一種有效的CCR2配體）的動物中，這種擴增沒有受到影響（圖1b）。故神經損傷通過表達csf1的感覺神經元與DRG巨噬細胞的相互作用而使後者擴增，這種效應不依賴於CCL2。
接著作者研究了神經損傷導致的DRG巨噬細胞的擴增或激活是否會反過來影響感覺神經元。結果顯示SNI小鼠的L4和L5DRG區BDNF mRNA增加4倍，AP預處理則完全抑制了這種增長（圖1c）。由於qPCR不能確定BDNF的增加是來自感覺神經元還是來自周圍的非神經元細胞，故進一步使用原位雜交技術（ISH）。圖1d，e顯示，在POD1，感覺神經元而不是周圍的非神經元細胞中BDNF mRNA上調。且ISH與qPCR分析結果一致。故雖然巨噬細胞不表達BDNF，但它們是感覺神經元中神經損傷引起BDNF上調的關鍵因素，而且是必要的。
圖1
為了確定DRG巨噬細胞的活化如何影響感覺神經元，作者研究了IL-1β、TNFα，它們在DRG的神經細胞和非神經細胞中都有表達，並且與神經病理性疼痛有關。在POD1，造模側L4/L5 DRG中IL-1β的基因表達幾乎上調了10倍（圖f）。3天AP方案預處理，不僅消除了DRG中IL-1β的上調，而且還降低了對側DRG的基線表達。使用ISH確定POD7 時IL-1β上調的細胞（圖g，h）。儘管既往的免疫組化研究顯示損傷誘導的IL-1β在星形膠質細胞和感覺神經元中表達，但出人意料的是，僅在Itgam+（即CD11b）巨噬細胞（圖i-l）中檢測到IL-1β。TNFα水平不受神經損傷以及AP預處理的影響。對於抗炎因子IL-10和TGFβ而言，前者表達水平低到檢測水平以下，後者並未發生改變。以上結果表明神經損傷後IL-1β的上調主要來源於DRG巨噬細胞，減少巨噬細胞耗的抗超敏作用部分是由於IL-1β減少所致。
圖2
8、DRG巨噬細胞的擴增具有性別差異
既往研究顯示脊髓小膠質細胞對神經病理性疼痛的作用在雌雄小鼠體內具有差異。故本研究試圖解答DRG巨噬細胞對神經損傷引起的機械性超敏反應是否也存在性別差異。在POD4，對雌性WT小鼠DRG的FACS分析顯示，造模側DRG中的巨噬細胞顯著增加（1.69±0.21倍）但程度弱於雄性。另一方面，儘管的條件性敲除Csf1阻止了雄性小鼠巨噬細胞的擴增，但在雌性小鼠中，條件性敲除Csf1和整體敲除CCL2都沒有阻止巨噬細胞的擴增（圖a）。顯然，一定有其他感覺神經元衍生因子影響了雌性小鼠巨噬細胞的擴增。
對巨噬細胞在SNI誘導的雌性小鼠機械性超敏反應的作用進行研究。與雄性小鼠一樣，三日AP注射方案導致的巨噬細胞耗竭延遲了機械性超敏反應的發生（圖b）。與雄性小鼠一樣，雌性小鼠的脊髓小膠質細胞沒有受到影響。此外，AP預處理後4周，當出現明顯的機械性痛覺超敏反應時，繼續給予AP也會導致雌性小鼠痛覺超敏反應的短暫逆轉，儘管逆轉幅度較小（60%）（圖c）。此外對於缺乏CCL2的雄性和雌性動物，SNI誘導的機械性超敏反應在雄性和雌性小鼠中具有可比性（圖d）。綜上所述，我們認為DRG巨噬細胞有助於雄性和雌性小鼠神經損傷誘導的機械性超敏反應的發生和維持，但CSF1對神經損傷誘導的DRG巨噬細胞擴增的貢獻存在性別差異。
結論
該研究證明，雄性和雌性小鼠的DRG內巨噬細胞對於進神經病理性疼痛的發生和維持是必要的。研究也發現在神經損傷的背景下，DRG中巨噬細胞和感覺神經元之間存在著相互作用，這也為神經病理性疼痛的管理提供了潛在靶點。
原始文獻：
Yu X, Liu H, Hamel KA, et al. Dorsal root ganglion macrophages contribute to both the initiation and persistence of neuropathic pain. Nat Commun. 2020;11(1):264. Published 2020 Jan 14. doi:10.1038/s41467-019-13839-2
作 者：王 沛
排 版：蔣 明
校 審：方 芳
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