心血管疾病是現今人類死亡的首位病因，其背後的主要病理改變是動脈粥樣硬化（atherosclerosis），表現為大中型動脈中緩慢脂質堆積形成斑塊，並伴有慢性炎症反應。
「atherosclerosis」一詞，最早由德國萊比錫病理學家 Marchand 於 1904 年正式提出。而在此之前，已有病理學家屍體解剖時在死者冠狀動脈內發現沙礫狀物質以及血管硬化、骨化，並提出這可能是造成心絞痛的原因。
隨後，在 1913 年俄國病理學家 Nikolai Anitschkow 通過餵食富含膽固醇的葵花油，成功在家兔的大動脈誘導出粥樣斑塊病變，為動脈粥樣硬化的動物實驗研究打開了大門。
一、動脈粥樣硬化小鼠模型
目前用於動脈粥樣硬化研究的動物模型種類眾多，包括小鼠、大鼠、兔、豬和非人靈長類等。每種動物模型各有其優缺點。與其他動物相比，小鼠體型小，繁殖速度快，近交系繁殖降低了個體差異，增強了實驗結果的穩定性和可重複性。另外，基因編輯技術在小鼠中的廣泛應用，使得靶向刪除或敲入某個基因，對其進一步功能研究變得更為方便。
C57BL/6 是這些研究中最常用的近交小鼠品系，它被用作大多數轉基因品系的遺傳背景。野生型 C57BL/6 小鼠對動脈粥樣硬化具有天然抗性，其循環中的膽固醇主要以 HDL-c 的形式存在，這與人類中的主要成分 LDL-c 顯著不同，因此，即使在高脂高膽固醇飲食餵養下，野生型 C57BL/6 小鼠也不會形成明顯的粥樣斑塊。
圖1 不同飲食下Apoe-/- 小鼠主動脈根部油紅染色
A. Chow Diet B. 12108C, Research Diets
1992 年 Jane L. Breslow 與同事在胚胎幹細胞中運用同源重組的方法建立了 Apoe 基因敲除（Apoe-/-）小鼠模型。ApoE 缺乏損傷了肝臟對於乳糜微粒的攝取，嚴重影響了正常脂質代謝。Apoe-/- 小鼠循環中膽固醇主要存在於 VLDL 顆粒中，即使餵食普通飼料，血漿膽固醇仍可高達 10~15mmol/l (400~600mg/dl)，4~6 周便可見單核細胞在血管壁黏附，10 周左右可觀察到明顯斑塊（圖 1A）。給予高脂高膽固醇飲食餵養後血漿膽固醇可進一步增高至 20~30mmol/l，粥樣斑塊的發生也更早更快（圖 1B）。
另一種常用模型是 LDL 受體敲除（Ldlr-/-）小鼠，由 Ishibashi S. 與同事在 1993 年建立。LDL 受體識別載脂蛋白 ApoB100 和 ApoE，是肝臟攝取和清除循環中 LDL 的關鍵蛋白。Ldlr-/- 小鼠模擬了人類家族性高膽固醇血症的病理過程，需要高膽固醇飲食誘導動脈粥樣硬化的發生。目前最常用的高脂高膽固醇飼料為 Western diet (D12079B; Research Diets)，其中脂肪供能比為 45%，含有 0.15% 膽固醇。另一種常用飼料是 D12108C，脂肪供能比為 40%，含 1.25% 膽固醇。由於其膽固醇含量更高，因此促動脈粥樣硬化的作用也較 Western diet 更為顯著。
在以上兩種最為常用的基因敲除小鼠的基礎上，又衍生出了更多的基因工程小鼠。例如，人類 APOB100 轉基因 Ldlr-/- 小鼠 (HuBL 小鼠)，是將人類全長 APOB100 基因轉入小鼠體內。HuBL 小鼠在普通飼料餵養下能夠出現高膽固醇血症和動脈粥樣硬化表型，並且其血漿中膽固醇以 LDL-c 為主，這使得 HuBL 小鼠相較於 Apoe-/- 小鼠和 Ldlr-/- 小鼠更加接近人類的脂質譜結構，同時也能夠進一步在小鼠體內開展人類 apoB 的在體研究。
儘管小鼠和人類粥樣斑塊在結構上存在一定的相似性，但與人類不同的是，小鼠斑塊極少發生破裂導致心肌梗死等血栓事件，對斑塊穩定性和動脈血栓事件的研究有賴於新的動物模型。
小鼠模型的整條主動脈上均可形成粥樣斑塊，包括頭臂動脈、頸動脈、鎖骨下動脈等。同人類相似，這些斑塊主要發生於動脈小彎側和血管分叉處，可能與血流在此處形成湍流有關。由於粥樣硬化病變的嚴重程度與血管部位有關，為了更加準確地評估病變的嚴重程度和幹預效果，增強實驗結果的可靠性和穩定性，使研究結果能夠推廣，規範統一的斑塊評估策略必不可少。
對小鼠動脈粥樣硬化斑塊的評估通常分為兩個水平：1. 大體標本油紅染色，即取主動脈弓或全主動脈，經油紅染色後評估斑塊面積；2. 切片染色，將主動脈根部或頭臂動脈、頸動脈等冰凍切片後，行油紅、Masson、天狼星紅或免疫螢光等染色。冰凍切片不僅能夠評估斑塊的大小，還能夠對斑塊組分進行進一步分析。
二、小鼠處死和標本收集
1. 麻醉取血
採用異氟烷（濃度 2%，流量 10ml/min，與不同麻醉機設備有關）吸入麻醉後，摘除一側眼球採集血液，20 周齡雄鼠可收集 1ml 以上血液，室溫靜置 1~2 小時，待血液充分凝固後，3000 轉 / 分，離心 10 分鐘分離血清，-80℃保存備用。
2. 全身灌流
將小鼠仰臥位固定於解剖臺，從肋弓下緣兩側向上剪開胸腔，將胸壁和胸骨、肋骨整個向上翻起，充分暴露心臟。在右心房剪開一小口，將連有輸液器的針頭自心尖部插入左心室，採用預冷的生理鹽水或 PBS 進行全身灌流。全身灌流能夠減少血細胞在血管內堆積，有利於下一步染色分析。注意觀察，待右心房流出液體轉為澄清透明，肝臟由紅轉白，提示灌流效果較好。
3. 組織採集
圖2 小鼠主動脈及其分支結構圖
在體式顯微鏡（圖 2A）下去除心臟和主動脈弓附近的氣管、食管、胸腺以及多餘脂肪組織，充分顯示主動脈弓及其三大分支 —— 自左向右分別為頭臂動脈、左頸總動脈和左鎖骨下動脈（圖 2B-2C）。沿中線剪開腹壁，移除膈肌及腹腔內肝臟、脾臟、胃腸道、胰腺等器官，保留腹膜後的腎臟及脊柱旁的腹主動脈。在剪去腸繫膜動脈時，一定注意將腸道提起，在遠離主動脈處剪開，避免損傷腹主動脈。小心去除腹主動脈和腎動脈周圍脂肪組織，顯示完整的腹主動脈結構。自髂動脈分叉以下剪斷，沿脊柱向上剪去主動脈的細小分支使其游離，在靠近腎臟處剪斷腎動脈，在頸部將三根分支血管自遠端剪斷，最後，在靠近心臟位置將升主動脈剪斷。
將心臟置於 4% 的甲醛或 10% 多聚甲醛中固定。根據研究目的，若計劃行全主動脈斑塊評估，直接將整個主動脈浸入甲醛固定；若僅行主動脈弓斑塊評估，則在主動脈弓下方將血管截為兩段，主動脈弓部分採用甲醛固定，其餘部分液氮速凍用於後續 PCR 或 Western blot 分析。由於主動脈弓與降主動脈缺乏明顯分界線，目前多數將降主動脈發出第一肋間動脈處作為二者分界。
三、主動脈大體油紅染色斑塊評估
將充分固定後的全主動脈或主動脈弓從固定液中取出，加入生理鹽水或 PBS 清洗去除表面殘留的固定液。由於脂肪組織可被油紅染為亮紅色而幹擾斑塊觀察，染色前需要進一步在體式顯微鏡下使用精細鑷去除血管外膜的脂肪組織，注意輕柔操作，避免損傷血管。
將 Vannas 彈簧剪自升主動脈斷口處伸入血管管腔內，沿主動脈弓大彎側向遠端將主動脈弓及其三個分支縱向剖開至降主動脈處，然後沿小彎側向遠端縱向剖開整個主動脈。將剖開的主動脈內膜面朝上展開，用最小號的昆蟲針或針灸針固定於黑膠皿上。
配置油紅染液：稱取油紅 O 粉末 0.5g，加入異丙醇（98%）100ml，90℃水浴 1h，過濾後即為油紅 O 飽和液，取飽和液和雙蒸水按 3:2 混合，靜置 10 分鐘後過濾即為油紅 O 工作液，飽和液及工作液均避光保存。
向黑膠皿中加入油紅工作液將血管完全浸沒，置於 37℃水浴鍋中孵育半小時。棄去油紅染液，加入 75% 乙醇分化 2 次，每次 5min，加入生理鹽水或 PBS 洗去乙醇。
圖3 小鼠主動脈大體油紅染色和操作器械
向黑膠皿中加入生理鹽水或 PBS 浸沒血管後拍照（圖 3A-3B），採用 Image-Pro Plus 或 ImageJ 等軟體分別測量整個內膜和各個斑塊面積，以斑塊總面積除以整個內膜面積即為斑塊的相對百分比。採用百分比能夠消除小鼠體型差異所造成的影響。
全主動脈或主動脈弓大體油紅染色能夠定量評價發生粥樣硬化的血管表面積，但忽略了斑塊的厚度。因此，需要與主動脈根部切片染色相結合共同評價病變程度。
備註：1. 由於小鼠的血管管徑較小，分離所使用的手術器械較為特殊，包括小號的精細鑷和 Vannas 彈簧剪（圖 3C）。2. 黑膠皿為正常玻璃培養皿底部包被了一層黑色橡膠樣物質，可以用細針將血管固定於其上，並且在拍照時呈現黑色背景，與血管對比強烈。該皿也可使用蜂蠟等原料自製。3. 整個過程注意滴加 PBS 保持血管溼潤。
四、動脈粥樣硬化斑塊冰凍切片
圖4 小鼠主動脈根部冰凍切片方法示意圖
將經過甲醛充分固定的心臟移入 25% 蔗糖 PBS 溶液中脫水 48 小時以上，觀察到心臟沉在液體底部即為脫水完成。取出心臟，濾紙吸乾表面水分，使用鋒利的刀片沿與心臟長軸垂直方向切除心尖部 2/3（圖 4A），將剩餘部分切面向下置於冰凍切片包埋盒中，向其中加入 OCT 將組織完全浸沒，將包埋盒置於冰凍切片機中冷凍。凍好的組織塊可用錫箔紙包裹後 - 80℃冰箱保存。
將冰凍切片機溫度設為 - 20℃，切片厚度設為 10µm。將凍好的組織塊心室面朝外固定於樣本託，將樣本託安裝在載物臺上，調整刀片角度以保證切片方向與主動脈根部保持垂直。採用普通載玻片觀察切片位置。最初切片上僅可見心肌組織，此時可每隔 200µm 留取一張切片顯微鏡下觀察。隨著切片位置逐漸靠近左室流出道，將觀察間隔縮短為 100µm。當鏡下觀察到二尖瓣時，將觀察間隔進一步縮短至 50µm。
保證切片方向真正與血管走行方向垂直對斑塊定量極為關鍵。切面傾斜會導致對斑塊大小的錯誤判斷。據估計，僅僅 20° 的傾斜便會造成對斑塊絕對面積接近 15% 的高估。而通過對距離主動脈竇不同部位的多個切片綜合評估，能夠降低這種切面傾斜所帶來的誤判。因此，為了能夠更加準確的評價斑塊大小，我們推薦採用以下切片方案。當鏡下觀察到第一個主動脈瓣出現時，該位置即為切片的「零點」。朝平行該瓣膜方向調整刀片角度，以使第二個瓣膜儘快出現。當第二瓣膜出現後，依同樣方式調整刀片角度，以儘快出現第三瓣膜。刀片調整前後切片位置間距離不應超過 50µm。當三個瓣膜都出現後，從距離「零點」90µm 處開始收集切片於包被多聚賴氨酸的粘附載玻片上。每個樣本留取 10 張切片，切片留取方式如圖 4B 所示，其上所示數字為切片位置距離「零點」的距離。
除主動脈根部外，頭臂動脈、頸動脈等也可行冰凍切片和染色，具體方法與
主動脈類似，需要儘可能保持切片方向與血管走行方向垂直，其應用相對較少，此處不再贅述。
五、動脈粥樣硬化斑塊切片染色與定量評價
對動脈粥樣硬化病變程度的評估不應僅僅關注於斑塊大小，對斑塊結構的分析同樣關鍵。在人類中，容易發生破裂的「易損斑塊」往往具有大的壞死核和薄纖維帽，斑塊中平滑肌細胞和膠原纖維含量較少，而炎症反應較重。儘管在小鼠模型中斑塊破裂現象極為少見，對於斑塊中膠原、平滑肌、巨噬細胞、T 細胞以及粘附因子如 VCAM-1、ICAM-1、炎症因子如 IFN-γ 等組分的分析對於評價斑塊的穩定性仍具有一定意義，可以通過對主動脈根部多張冰凍切片進行不同染色來檢測這些組分。主動脈根部粥樣斑塊常用染色方法如下。
圖 5-1 小鼠主動脈根部油紅和Masson染色
1. 油紅 O 染色
油紅 O（Oil Red O）是一種脂溶性偶氮染料，是很強的脂溶劑和染脂劑，能特異性地使組織和細胞內中性甘油三脂、脂質以及脂蛋白等染色。動脈粥樣硬化斑塊中由於富含脂質，能夠被油紅 O 染為紅色，因此常常用於斑塊大小和脂質含量的評價。
染色完成後，光鏡下觀察拍照，圖像採用 Image-Pro Plus 或 ImageJ 等軟體分別計算管腔面積和斑塊面積，將斑塊總面積除以管腔面積即為斑塊的相對大小。另外，也可根據拍照時的標尺計算斑塊的絕對面積，單位通常為 mm2 ；或者採用軟體計算圖像中紅色部分面積，除以斑塊總面積，即為斑塊中脂質含量百分比（圖 5-1A）。左右冠狀動脈通常從距離主動脈竇 250µm 左右的部位發出，該位置同時也是斑塊最嚴重的部位，因此，該處切片常常作為代表圖像用於結果展示。
2. Masson 三色染色
Masson 三色染色是經典的評價膠原纖維的染色技術，能夠區分膠原纖維和肌纖維，染色後肌纖維呈紅色，膠原纖維呈藍色，可用於評估粥樣斑塊中的膠原含量。
染色完成後，光鏡下觀察拍照，採用 Image-Pro Plus 或 ImageJ 等軟體計算圖像中深藍色部分面積，除以斑塊總面積，即為斑塊中膠原含量百分比（圖 5-1B）。通常認為，斑塊中膠原相對含量越高，提示斑塊越穩定。
3. 天狼星紅染色
同 Masson 三色染色目的相同，天狼星紅染色也用於對膠原含量的評價。在普通光學顯微鏡下，心臟血管等組織中的膠原纖維被染成紅色，肌纖維被染成黃色。在偏振光顯微鏡下，能夠進一步區分各型膠原。在偏振光顯微鏡下，Ⅰ 型膠原纖維呈紅色或黃色，排列緊密，具有強雙摺光性；Ⅱ 型膠原纖維色彩多樣，疏鬆網狀，弱雙摺光性；Ⅲ 型膠原纖維呈綠色，細纖維，弱雙摺光性；Ⅳ 型膠原纖維為淡黃色，弱雙摺光性。
圖 5-2 小鼠主動脈根部天狼星紅染色
染色完成後，普通顯微鏡（圖 5-2A）或偏振光顯微鏡（圖 5-2B）下觀察拍照，採用 Image-Pro Plus 或 ImageJ 等軟體計算圖像中膠原面積，除以斑塊總面積，即為斑塊中膠原含量百分比。通常認為，斑塊中膠原相對含量越高，提示斑塊越穩定。
4. 免疫螢光
圖 5-3 小鼠主動脈根部冰凍切片免疫螢光染色
採用針對特定蛋白的一抗和相應標有螢光基團的二抗對斑塊中的某些成分進行免疫螢光染色，以評估相應抗原在斑塊中的表達情況。其中最常用的包括抗 α-SMA，用以顯示平滑肌細胞，和抗 CD68 抗體，用以顯示巨噬細胞。
染色完成後，在螢光顯微鏡下觀察拍照，採用 Image-Pro Plus 或 ImageJ 等軟體計算圖像中相應顏色螢光面積，除以斑塊總面積，即為斑塊中相應抗原百分比。例如圖 5-3 中，綠色螢光顯示平滑肌細胞內的 α-SMA（圖 5-3A），紅色螢光顯示巨噬細胞表面抗原 CD68, 分別用綠色和紅色螢光面積除以各自斑塊面積，即為斑塊內平滑肌細胞和巨噬細胞的相對含量。
除上述常用染色方法外，HE 染色、TUNEL 螢光染色、針對不同抗原的免疫組化染色等，也被用來對斑塊的大小和組分進行評價。按照本文第四部分所述的切片留取方法，每隻小鼠留有 10 張主動脈根部不同水平的冰凍切片，能夠滿足多種染色需求。根據實驗目的合理選擇多種不同染色方案對斑塊進行綜合全面評估，對動脈粥樣硬化的病理研究具有重要意義。
六、總結
基因工程小鼠是目前最常用的動脈粥樣硬化動物模型，為人類探索疾病的病理機制、尋找治療靶點、開發新型藥物做出了巨大貢獻。動脈粥樣硬化的發生發展是一個慢性過程，即使在小鼠體內，造模也常常需要花費數月時間。造模完成後，如何準確評價病變程度又是一個挑戰。小鼠主動脈的各個部位均可形成粥樣斑塊，不同部位斑塊大小和組成存在顯著差異。為了更加準確地評估病變的嚴重程度和幹預效果，增強實驗結果的可靠性和可重複性，參考既往發表文獻，本文提供了一套規範的取材、染色和定量流程，希望對於相關領域的研究者們能起到一定的幫助。
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