NADPH對大腸桿菌生產游離脂肪酸的影響

2021-01-14 代謝工程與合成生物學

本文是由美國的Ka-Yiu San教授於2017年9月發表在Biotechnology and Bioengineering期刊上。作者目前是萊斯大學的生物工程教授，主要對代謝工程領域進行研究。

研究背景：

脂肪酸作為生物柴油和一些化學品的前體物，其市場需求越來越多。在大腸桿菌中，脂肪酸生成是以乙醯-CoA為前體物，在乙醯-CoA羧化酶的作用下生成丙二醯-CoA，再通過縮合(fabH)/還原(fabG)/脫水(fabZ)/還原(fabI)，進行多輪的碳鏈延長，之後在乙醯-ACP硫酯酶(TE)的作用下，生成脂肪酸。

在碳鏈延長循環過程中，有兩步還原反應，其中fabG只能利用NADPH作為輔因子，fabI可利用NADPH或NADH作為輔因子。在大腸桿菌中，還存在兩種轉氫酶，一個是與細胞膜結合的PntAB，另一個是可溶性轉氫酶UdhA，兩者均可催化NADH生成NADPH。還存在一種NAD+激酶（由nadK基因催化），可催化NAD+生成NADP+。本文通過截斷NADPH的生成，並過表達兩種轉氫酶以及NAD+激酶，來增加NADPH的生成，進而研究NADPH對脂肪酸生成的影響。

文章脈絡：

1.作者以之前構建的ML103(MG1655;fadD-)，ML211(MG1655 ;fadD-, fabR-)，ML212(MG1655 ;fadD-, fabR-, sucC-)為研究對象，分別敲除zwf(編碼6-磷酸葡萄糖脫氫酶)基因，得到WLK306/WLK307/WLK308菌株。分別導入PXZ18質粒(過表達TE基因)後，脂肪酸的產量均下降約90%，乙酸含量增大，同時造成葡萄糖的消耗減慢。

2. 在ML103菌株的基礎上，分別單個敲除udhA/pntAB得到菌株WLK309/WLK310，同時敲除udhA和pntAB，得到菌株WLK311。WLK309(PXZ18)與對照ML103(PXZ18)相比，脂肪酸的產量相似，變化不大；WLK310(PXZ18)脂肪酸的產量下降11.7%；。說明在生成NADPH方面，pntAB基因作用更大。WLK311(PXZ18)脂肪酸產量下降88.8%，說明在脂肪酸的合成過程中，NADPH是重要的影響因素，PP途徑不能夠滿足脂肪酸生產過程中的NADPH。

有文獻報導fabZ基因的過表達可以提高脂肪酸的產量，隨後將質粒PXZ18Z(同時過表達TE和fabZ基因)導入WLK309/WLK310/WLK311菌株。WLK309(PXZ18)、WLK310(PXZ18Z)、WLK311(PXZ18Z)與對照ML103(PXZ18Z)相比，脂肪酸產量分別下降約20%/24%/92%。說明高產脂肪酸時，NADPH對脂肪酸產量的影響更大。

3. 在空載體pBAD33的基礎上構建了五種質粒，分別是pBADP(過表達pntAB)/pBADU(過表達udhA)/pBADN(過表達nadK)/pBADNU(同時過表達nadK和udhA)/pBADNP(同時過表達nadK和pntAB)。將五種質粒分別導入到WLK306菌株中，與對照WLK306(pBAD33)相比，WLK306(pBADU)脂肪酸產量幾乎沒有變化，WLK306(pBADP)、WLK306(pBADN)、WLK306(pBADNU)、WLK306(pBADNP)分別提高12.6%/33.9%/57.9%/627%。表明在提高NADPH生成方面，轉氫酶與NAD+ 激酶具有協同作用。

4. 隨後將pBADNP質粒分別導入WLK309/WLK310/WLK311菌株中，與攜帶空載體的菌株相比，WLK309(pBADNP)脂肪酸產量沒有變化；WLK310(pBADNP)、WLK311(pBADNP)產量分別比對照提高25%和5.9倍。再次說明在脂肪酸的生成過程中，pntAB基因的作用強於udhA，並且同時過表達pntAB和nadK可恢復NADPH的生成量。

5. 最後作者將碳源由葡萄糖改為甘油做了進一步研究。以甘油為底物進行發酵，產生1mol乙醯-CoA時生成2mol的NADH。與以葡萄糖為碳源時相比，多產生1mol的NADH。以甘油為碳源時，發現ML3103(pBADNP)、WLK309(pBADNP)、WLK310(pBADNP)、WLK311(pBADNP)脂肪酸的含量比對照分別提高20%/38%/52%/49%。說明在脂肪酸的生產過程中， NADH也是影響脂肪酸生成的關鍵因素。


脂肪酸的代謝途徑如下：



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