關注▲對話酵素▲，帶你讀懂酵素
酵素的發酵方式分為接菌發酵和自然發酵，接菌發酵是利用一種或者多種微生物作為起始發酵劑進行發酵。自然發酵主要是依賴於水果和自然環境中的優勢菌群進行發酵，具有更豐富的微生物組成和代謝過程，其品質和風味也優於接菌發酵。然而在自然發酵過程中，酵素體系中的微生物群落構成不斷變化，生成不同的代謝物，且又受到代謝產物的影響，使其發酵規律難以掌控。在實際生產中，發酵過程中不同時間的微生物群落結構與代謝物的變化規律與酵素的品質、功能和安全性密切相關，發酵時間選擇和過程調控需要結合微生物的群落結構變化以及產物實際情況進行綜合考慮。其中有機酸既被微生物用作碳源和電子供體，又是微生物的發酵產物，有機酸積累所導致的酸性環境還對某些微生物有抑制作用。因此，亟待進行水果酵素髮酵過程中的微生物群落與有機酸產物的動態變化綜合分析與評價，這有助於闡明水果酵素的發酵過程，控制酵素產品品質，同時對酵素工業化生產具有重要意義。
本實驗以3種物料與糖典型比例的水果酵素為研究對象，研究其在發酵周期0～150d不同發酵時期的微生物動態變化以及7種主要有機酸變化過程，運用冗餘分析對微生物群落組成與有機酸變化聯合分析，以期揭示水果酵素在自然發酵過程中的微生物共性演變規律及在演替過程中有機酸的環境推動力，為指導自然發酵水果酵素實際生產、實現水果酵素工業生產工藝改進和產品品質穩定提升提供技術支撐。
01
材料與方法
材料與試劑
蘋果、香蕉、梨、山楂、火龍果、香橙、檸檬、柚子、葡萄、獼猴桃、紅糖（一級品）、白砂糖（一級品）。
有機酸標準品；十六烷基三甲基溴化銨、十二烷基硫酸鈉；β-巰基乙醇、丙烯醯胺、甲叉雙丙烯醯胺、去離子甲醯胺；RNase、6×loading bufferv；PCR引物；其他均為國產分析純。
儀器與設備
K5600型超微量分光光度計；MultiskanFC酶標儀；TGL16M高速臺式離心機；1260高效液相色譜儀；S1000TMPCR儀、Power Pac電泳儀；Tanon4600SF全自動數碼凝膠/化學發光圖像分析系統。
方法及數據分析
選取原料水果，等質量比混勻，無菌水清潔表面，均勻切塊。結合預實驗發酵情況與其他研究選擇糖與物料的比例與發酵時間，將水果與紅糖以質量比1∶1、2∶1、3∶1（水果酵素A、B、C）加入滅菌發酵罐中，封口，自然發酵，分別在發酵0、30、60、90、120d取樣，10000r/min離心10min棄去沉澱，上清液即為水果酵素原液，-20℃條件下保存，進行有機酸含量測定、微生物多樣性分析，並採用軟體Quantity One讀取DGGE圖譜上條帶的數目與光密度值，並進行UPMGA（非加權組平均算法）聚類分析，生成DGGE圖譜相似性分析圖，並根據DGGE數位化後的數據計算微生物多樣性指數，包括微生物多樣性指數、豐富度和均勻度指標。
02
結果與分析
有機酸的測定結果
圖1 有機酸標準品（A）與樣品A 0 d(B）高效液相色譜圖
1.酒石酸；2.奎寧酸；3.草酸；4.蘋果酸；5.莽草酸；6.抗壞血酸；7.乳酸；8.檸檬酸；9.富馬酸；10.琥珀酸。
乳酸、檸檬酸、草酸和蘋果酸是水果酵素中的主要有機酸，同時還含有少量的酒石酸、莽草酸和綠原酸。
圖2 水果酵素A、B、C在發酵過程中有機酸含量的變化
A、B、C分別為水果酵素A、B、C有機酸含量變化。**.同一樣品與上一時間點相比差異極顯著（P<0.01）。
如圖2所示，在發酵前後酵素中主要有機酸含量均發生變化。此外，不同樣品在發酵不同階段有不同的有機酸變化，水果酵素A的草酸與檸檬酸在發酵30d出現峰值，乳酸在發酵90d出現峰值；水果酵素B的草酸與乳酸在發酵60d出現峰值，檸檬酸在90d含量最高；水果酵素C的草酸在發酵60d出現最大值，在發酵90d乳酸與檸檬酸出現最大值。不同糖與物料比的水果酵素在自然發酵過程中可以有針對性地選擇合適的發酵階段，保障酵素功能品質。
水果酵素髮酵過程中的微生物多樣性
圖3 水果酵素的細菌16S r DNA V3區DGGE指紋圖譜（A）及條帶簡圖（B)
a～q為選取的電泳條帶；1～18.酵素細菌的DGGE泳道，其中1～3為發酵0d酵素A、B、C,4～6為發酵30d酵素A、B、C,7～9為發酵60d酵素A、B、C,10～12為發酵90d酵素A、B、C,13～15為發酵120d酵素A、B、C,16～18為發酵150d酵素A、B、C，圖4、5同。
如圖3所示，每條泳道代表不同發酵時間的水果酵素細菌的DGGE圖譜，不同位置的條帶則代表不同種屬的微生物，條帶亮度反映微生物豐度高低，條帶數量代表菌落多樣性。由圖3可知，各條帶的遷移率及光密度值均有一定差異，可以判斷3種水果酵素在發酵過程中細菌種類和含量均在不斷發生演替變化。
從18份樣品的DGGE圖譜上共標記出19條特異性條帶，對條帶進行克隆測序，將檢測出的條帶序列在NCBI資料庫中進行BLAST比對分析，結果如表1所示。
表1 不同發酵階段的水果酵素樣品中細菌16S rDNA V3區PCR-DGGE特異性條帶鑑定結果
由表2可知，在水果酵素樣品細菌DNA的DGGE圖譜上找到19條特異性條帶，對其進行分析的結果為：7株乳酸菌，2株瓊脂酶產生菌，2株腸桿菌、1株腸球菌，2株假單胞菌，以及3株不可培養微生物，另外有2株菌未檢測到。
本研究發現不同的糖與物料比影響水果酵素初始環境的滲透壓，也影響發酵過程中多種微生物群落的含量變化和優勢菌群，因此在相同發酵階段，不同樣品的泳道條帶數與亮度存在異同。同一樣品在不同發酵階段的菌群變化也十分明顯。
PCR-DGGE結果聚類分析
圖4 水果酵素的細菌DGGE指紋圖譜聚類分析
如圖4所示，0d與其他階段酵素的細菌菌群相似性較小，說明酵素在發酵後菌群變化較大；30d後的水果酵素相似性較大，其中水果酵素B、C發酵30d與60d樣品較為接近，與0d樣品具有較為明顯的差異，可能是由於水果酵素B、C在該階段有相似度較高的細菌種群結構。除此之外，水果酵素A在60d與90d的群落較為相近，可能是水果酵素A在發酵過程中的細菌菌群交替生長的結果。
細菌種群多樣性PCR-DGGE分析
由表2可知，不同樣品中細菌種群的均勻度較為接近，但是豐富度和多樣性指數差別較大。0d時樣品具有較高的豐富度和多樣性，可能是由於發酵初期菌群不穩定，微生物均為果蔬內部或表皮攜帶的自然菌群；隨著發酵進行，部分細菌逐漸佔據優勢地位，可以維持菌群結構的穩定。在發酵後期，泳道18（水果酵素C發酵150d）中多樣性指數和豐度最高，分別為2.76和16.00，可能是由於該發酵階段優勢菌群衰竭，也可能由於雜菌的汙染。此結果和DGGE圖譜的直觀觀測結果一致。
表2 水果酵素細菌菌群多樣性分析
相關性分析
RDA結果見表3，第1軸與第2軸特徵值分別為0.396和0.150，微生物群落與有機酸的相關性分別為0.958和0.950，累積典範特徵值為0.688，蒙特卡羅檢驗值小於0.05，因此排序結果可以在一定程度上解釋微生物群落組成與環境有機酸含量之間的相互關係。
表3 RDA結果
從圖5可知，不同時期的樣品主要分布在3個區域。
圖5 微生物群落與有機酸變化RDA
03
結論
本研究應用RDA方法對微生物在水果酵素髮酵過程中微生物組成結構變化與標誌性產物有機酸之間的對應關係進行了研究，證實了RDA在微生物群落變化與有機酸相關性分析中的可行性，確定在發酵過程中與特徵物質生成與代謝有關的主要微生物，對闡明水果酵素髮酵過程、指導水果酵素生產加工技術有重要參考價值。RDA表明對檸檬酸生成貢獻率較大的菌株分別為L.plantarum>unculturedBrevundimonassp.>E.xiangfangensis>unculturedLactococcus sp.，對乳酸生成貢獻率較大的菌株分別為L.plantarum>L.lactissubsp.>E.xiangfangensis>L.lactissubsp.>unculturedLactococcus sp.。
免責聲明：本文來源，李希羽等《水果酵素自然發酵過程中優勢菌群與有機酸變化規律分析》。此文章僅為分享知識，如有侵權請聯繫刪除。
分享、在看與點讚
對話酵素，表達你的態度