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愛滋病（acquired immunodeficiency syndrome, AIDS）是一種由人類免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus, HIV）感染所引起的對人類健康具有極大危害的傳染病。根據中國CDC的數據統計，愛滋病的新發病例數和死亡人數均呈逐年上升趨勢，截至2018年底，中國存活愛滋病感染者約125萬人。HIV包括HIV-1 和HIV-2兩種類型，其中HIV-1是導致AIDS的主要病原。HIV通過性接觸、血液、母嬰垂直感染等方式感染人體內的CD4+ T淋巴細胞，損害機體的免疫系統，從而引起各種致死性的機會性感染或惡性腫瘤發生。自1983年法國Françoise Barré-Sinoussi和Luc Montagnier發現分離HIV病毒以來，人類在過去30多年中對HIV的致病機理和ADIS防治方法上取得了巨大的進步，特別是1996年美籍華裔科學家何大一提出的高效抗逆轉錄病毒（highly active antiretroviral therapy, HAART）療法使曾經致命的AIDS成為大部分患者可以長期生存的慢性病。然而，在靶細胞中潛伏的HIV-1前病毒處於轉錄抑制狀態，可以逃避宿主免疫系統和HAART的攻擊。當停止HAART治療後，前病毒會發生迅速的基因轉錄激活和複製，導致患者體內出現大量病毒顆粒並產生AIDS臨床症狀【1】。因此，HIV-1的潛伏感染是治癒AIDS疾病的最主要障礙。深入研究HIV潛伏感染和複製的分子機制能夠揭示新的抗AIDS藥物設計靶點並有望根除患者體內潛伏感染的HIV病毒以實現AIDS的徹底治癒。
HIV屬於逆轉錄病毒科，其基因組由兩條相同的單正鏈RNA組成，病毒顆粒內含有逆轉錄酶（reverse transcriptase, RT）和整合酶（integrase， IN）。在RT的催化下，病毒基因組RNA轉變為dsDNA，隨後在IN和宿主細胞輔因子LEDGF/p75的協助下，dsDNA選擇性地整合至轉錄活躍的宿主染色質區域，形成前病毒並進入轉錄沉默的潛伏狀態。前病毒基因轉錄由長末端重複序列（long terminal repeat，LTR)所驅動，其活性受到病毒自身蛋白、宿主轉錄因子、染色質修飾和結構變化以及RNA聚合酶II轉錄暫停與釋放等多種因素的調控【1】。LEDGF/p75是含有PWWP結構域的染色質修飾結合蛋白，除了通過結合IN調控HIV在宿主基因組上的選擇性整合外，LEDGF/p75還可以作為細胞內多個蛋白質複合體的結合因子，參與調控多種生物學過程，包括染色質修飾、基因轉錄、選擇性剪接等【2-4】。HIV前病毒會劫持宿主細胞內的表觀遺傳與轉錄調控機制來激活或沉默病毒基因轉錄，從而維持自己的潛伏和複製。鑑於LEDGF/p75在調控宿主細胞基因轉錄中的重要作用，其除了調控HIV選擇性整合外，是否影響整合後前病毒在宿主細胞內的複製命運？
2020年5月15日，天津醫科大學/實驗血液學國家重點實驗室的胡德慶課題組與高欣博士合作在Science Advances在線發表了題為「Competition between PAF1 and MLL1/COMPASS confers the opposing function of LEDGF/p75 in HIV latency and proviral reactivation」的研究論文（第一作者為2018級博士研究生高茹），報導了 LEDGF/p75在HIV前病毒潛伏感染與複製激活中對病毒基因轉錄調控具有截然相反的功能，並揭示其分別依賴於PAF1與MLL1/COMPASS複合體在轉錄延伸和染色質修飾層面發揮功能的作用機制，為HIV潛伏感染與複製的表觀遺傳與轉錄調控機制提供了新的認識，並為清除宿主細胞內潛伏感染的前病毒提供了潛在的藥物幹預靶點。
在這項研究中，作者首先利用兩種HIV潛伏感染的細胞模型發現缺失LEDGF/p75後，處於潛伏狀態的前病毒基因出現了自發的轉錄激活。而當作者誘導宿主細胞內前病毒複製時，敲低LEDGF/p75表達卻抑制了病毒基因的轉錄激活，提示LEDGF/p75在前病毒潛伏維持和複製中具有抑制和激活病毒基因轉錄的功能。降低LEDGF/p75的表達，處於活躍轉錄狀態的病毒基因不能有效地恢復到轉錄抑制狀態，說明LEDGF/p75在建立前病毒潛伏狀態中也發揮重要功能。那麼LEDGF/p75是利用什麼機制來抑制潛伏狀態前病毒的基因轉錄呢？作者利用了親和純化和定量質譜（multidimensional protein identification technology，MudPIT）的方法與功能實驗手段，發現PAF1複合體可以與LEDGF/p75結合併在HIV前病毒潛伏感染的建立和維持中發揮重要功能。但是，缺失PAF1複合體並不影響前病毒複製過程中病毒基因的轉錄激活。
為了揭示LEDGF/p75與PAF1在潛伏狀態時抑制前病毒基因轉錄的作用機制，作者分別利用了HIV-LTR和Gal4 UAS-HIV-LTR兩套螢光報告系統，發現LEDGF/p75與PAF1以相互依賴的方式直接抑制HIV LTR的轉錄活性，其中PAF1對LTR的轉錄抑制功能需要LEDGF/p75對其在LTR上的招募。哺乳動物的PAF1複合體最早由中國科學院生物物理所朱冰研究員在Danny Reinberg實驗室進行博士後研究期間分離鑑定【5】。早期的研究認為其功能是通過與RNA聚合酶II結合促進基因的轉錄延伸。近年的研究發現PAF1複合體不僅可以促進基因轉錄延伸，而且在基因啟動子下遊RNA聚合酶II轉錄暫停的建立、轉錄終止、mRNA poly(A)加尾以及選擇性剪接等過程發揮功能 【6】。潛伏狀態HIV前病毒LTR的一個最明顯的特徵是RNA聚合酶II的轉錄暫停（RNA Pol II pausing），作者發現敲低PAF1和LEDGF/p75的表達可以釋放LTR上處於轉錄暫停的RNA聚合酶II，說明LEDGF/p75是通過PAF1在前病毒LTR上建立RNA聚合酶II的轉錄暫停來抑制病毒基因轉錄，從而建立和維持前病毒的潛伏感染。
為了研究LEDGF/p75在複製時對前病毒基因轉錄的激活機制，作者檢測了LTR上的染色質修飾變化情況，發現H3K4me3水平在前病毒複製時急劇上升，提示H3K4甲基轉移酶可能參與調控了複製時前病毒基因的轉錄激活。論文通訊作者在Ali Shilatifard實驗室學習期間，專注於組蛋白H3K4甲基化修飾建立的生化機制研究，系統揭示了COMPASS複合體成員在建立染色質不同區域H3K4甲基化修飾中的作用【7-9】。隨即作者分別檢測了COMPASS家族成員在複製中對前病毒基因轉錄的調控作用，發現MLL1/COMPASS複合體是建立和維持病毒基因轉錄激活所必需。以往的研究發現，LEDGF/p75是MLL1/COMPASS複合體的結合蛋白，可以招募染色體異位所形成的MLL1融合蛋白至與造血幹細胞自我更新調控相關的基因上，導致其異常轉錄激活，從而促使白血病的發生【3，10】。作者發現LEDGF/75在MLL1/COMPASS複合體結合至LTR及其在病毒基因轉錄激活中發揮重要作用，說明HIV前病毒複製和MLL1異位蛋白採用類似的表觀機制促進了疾病的發生與進展。
蛋白質截斷體相互作用的實驗發現PAF1和MLL1結合在LEDGF/p75的IBD (integrase binding domain) 結構域上，並揭示它們與LEDGF/p75的相互作用是相互排斥的。作者發現在前病毒複製過程中，MLL1與LEDGF/p75和LTR的結合增加，而PAF1與LEDGF/p75和LTR結合減少。那麼是什麼機制使LEDGF/p75在HIV潛伏感染狀態下與PAF1的結合轉變為複製時與MLL1結合呢？結構生物學的研究發現，MLL1通過IBM （IBD biding motif）基序以磷酸化修飾依賴的方式與LEDGF/p75結合(11)。作者隨即分析了MLL1 磷酸化修飾的質譜數據，發現IBM區域的S136，S142和S153位點在體內可以被磷酸化修飾。對這三個位點進行定點突變顯示其磷酸化修飾在MLL1與PAF1競爭性地結合至LEDGF/p75和LTR中發揮關鍵作用。
為了尋找前病毒複製時對MLL1進行磷酸化修飾的激酶，作者分析了MLL1相互作用蛋白的質譜數據，並對與MLL1結合的潛在激酶分別進行了敲低，發現激酶CSNK2-A2在IBM的磷酸化修飾以及MLL1與LEDGF/p75和LTR結合中起著重要作用。在潛伏感染的細胞系和原代CD4+T模型中誘導前病毒複製，發現轉錄因子NF-κB可以上調CSNK2-A2表達。敲低CSNK2-A2表達或幹擾其激酶活性可以顯著地抑制複製中病毒基因的轉錄激活。以上結果表明，在前病毒複製過程中，NF-κB介導的CSNK2-A2蛋白表達上調磷酸化修飾IBM基序，使MLL1競爭性地結合至LEDGF/p75並在LTR染色質區域建立H3K4me3；通過釋放結合在LTR的PAF1和招募SEC複合體來促使轉錄暫停的RNA 聚合酶II進行高效轉錄延伸（productive elongation），從而增強病毒基因的轉錄。
圖註：LEDGF/p75在HIV潛伏感染和複製時對病毒基因轉錄的調控功能及其作用機制
總的來說，該研究將染色質結合蛋白LEDGF/p75的功能從已知的調控HIV在宿主基因組的整合拓展到前病毒潛伏和複製時對病毒基因的轉錄調控中，並詳細闡明了轉錄延伸和表觀遺傳修飾在介導其調控病毒基因轉錄中的作用機制，為徹底清除宿主細胞內潛伏感染的HIV病毒提供了新的思路和藥物幹預的靶點。
胡德慶，天津醫科大學基礎醫學院教授，天津市醫學表觀遺傳學重點實驗室和實驗血液學國家重點實驗室PI， 博士生導師。2010年博士畢業於中國科學院生物物理研究所，之後在美國西北大學（Northwestern University）和美國斯託瓦斯醫學研究所（Stowers Institute for Medical Research）的Ali Shilatifard與Linheng Li （李凌衡） 實驗室進行博士後研究，完成在表觀遺傳學和幹細胞生物學兩個領域的專業訓練。目前以第一作者或通訊作者在Molecular Cell (2013, 2017), Nature Structure &Molecular Biology, Genes &Development, Science Advances等雜誌發表多篇研究論文，總引用1500餘次，5年內單篇最高引用200餘次，H指數19。胡德慶長期致力於表觀遺傳學與基因轉錄調控的分子機制研究，主要學術成績包括：
分離鑑定了哺乳動物的LEC (Little Elongation Complex)複合體 (Molecular Cell, 2013)；
鑑定了MLL2/COMPASS複合體建立bivalent染色質修飾的生化機制 (Nat Struct Mol Biol, 2013)；
鑑定了MLL3/MLL4/COMPASS複合體建立轉錄增強子表觀遺傳學標記-H3K4me1的分子機制 (MCB, 2014)；
發現活躍轉錄增強子的新型表觀遺傳學標記及其建立的生化機制以及在調控早期胚胎發育中的功能 (Molecular Cell, 2017)；5.發現轉錄暫停/延伸和表觀遺傳修飾在LEDGF/p75調控HIV潛伏感染與複製中的功能與作用機制 (Science Advances, 2020)。
專家點評
陳飛（復旦大學生物醫學研究院和附屬腫瘤醫院青年研究員，國家優秀自費留學生獎學金特別優秀獎入選者，研究方向：癌症表觀遺傳學）
實驗室網站：https://www.x-mol.com/groups/chenfei
HIV-1的潛伏感染是治癒愛滋病的最主要障礙。潛伏的HIV-1前病毒處於轉錄抑制狀態，能夠逃避機體自身的免疫攻擊和藥物治療。而HIV本身並沒有完整的轉錄機器，整合到宿主基因組上的病毒DNA序列能夠「劫持」（hijack） 宿主的轉錄調控因子和轉錄機器來介導病毒基因的轉錄激活或者沉默。然而，目前的研究還不清楚HIV-1前病毒是如何在沉默和激活之間切換，從而在完成病毒複製的同時能夠巧妙的逃脫免疫和藥物治療。而胡德慶課題組的發現，給這個棘手的問題，提供了一個重要的答案：病毒（前病毒）能夠利用宿主蛋白LEDGF/p75，通過選擇性招募PAF1和MLL1/COMPASS複合體來調控病毒基因的轉錄延伸和染色質修飾，從而來達到抑制（PAF1 ）和激活（MLL1/COMPASS）病毒基因表達的目的。這項工作對於開發HIV-1藥物治療有重要的指導意義。
我們之前的研究發現，PAF1在不同的物種（果蠅與哺乳動物細胞）中不僅可以調控轉錄延伸，還能結合在增強子和啟動上來加強RNA Pol II在基因TSS（Transcription start site）下遊的轉錄暫停（pausing），從而達到抑制細胞在生理和應激狀態下基因轉錄的目的（Chen F, et al, Cell, 2015; Chen F, et al, Science, 2017）。但目前我們還不清楚，在基因從沉默到激活的過程中，PAF1是如果從一個「轉錄暫停因子」轉變成一個「轉錄延伸因子」的。胡德慶課題組的發現，不僅解釋了PAF1是如何作為HIV限制因子來限制病毒基因的表達和複製的，而且為研究PAF1如何協同調控轉錄的不同步驟以及轉錄暫停如何被解除提供了新的思路。此外，該研究建立了PAF1在調控RNA Pol II 轉錄暫停中的作用與疾病發生之間的聯繫，為後續研究轉錄暫停和延伸機制在生理和病理過程中的調控功能起到了很好的範式作用。
原文連結：
https://advances.sciencemag.org/content/6/20/eaaz8411
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來源：BioArt
1980-2020
原標題：《【學術前沿】胡德慶/高欣聯合團隊揭示HIV潛伏感染與複製的表觀遺傳與轉錄調控機制》
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