共生奇文 | 奇文共欣賞，疑義相與析
共生奇文主要展示共生君Mutualist團隊推薦的優秀科學論文，不定期為您奉上學術盛宴！本期奇文為您介紹，RNA幹擾在葉蟎中的應用。作者：彭長武，南京農業大學碩士在讀，主要研究葉蟎的共生微生物。葉蟎屬於節肢動物門、蛛形綱、葉蟎屬，個體小、繁殖快，在我國分布廣泛，能夠為害多種花卉、果蔬和農作物，每年對農業生產造成巨大的經濟損失。目前葉蟎的防治方法主要是噴灑農藥，這導致葉蟎種群產生抗藥性大暴發而加重為害。研究葉蟎基因功能可以為綠色防治葉蟎提供重要的科學基礎。RNA幹擾（RNA interference，RNAi）是指外源或內源的雙鏈RNA（Double strand RNA，dsRNA）特異性地引起基因轉錄後沉默的現象。該技術具有高效、快速、特異性強等特點，被作為一種有效的方式用來研究基因功能，且能與轉基因技術結合防治害蟲。目前RNA幹擾技術已被廣泛應用於模式昆蟲（如果蠅）和一些非模式生物（如飛蝨）的基因功能研究中。RNA幹擾應用於葉蟎的相關研究已有不少文章報導，本文主要介紹RNA幹擾的作用機制，葉蟎在我國的為害情況，以及外源dsRNA導入葉蟎，沉默葉蟎基因表達的有效方法，並展望了該技術在葉蟎中的應用前景。
圖1 截形葉蟎雌成蟲示意圖
圖2 截形葉蟎雌成蟲和0.5mm水性筆筆跡對比，黑色對角斜線為水性筆的筆跡，葉蟎成蟲在圖中央。
1. 葉蟎在我國的為害情況
葉蟎有1300多個物種，分布廣泛，其中的100多種能夠為害眾多農林作物，與農業生產息息相關。葉蟎喜聚集於葉背面，且個體小不易察覺（個體大小僅0.2mm~0.9mm），早期難以發現進行防治（洪曉月，2012; Jin et al., 2018）。但葉蟎取食會使枝枯葉落，阻滯植物生長，極大的影響作物的質量和產量。每年在我國造成巨額經濟損失，圖3所示是本實驗室多年來調查所得的葉蟎種群分布圖，說明中國分布最廣泛的葉蟎是截形葉蟎。圖3 2008年至2017年葉蟎種群的採集信息，不同的顏色代表不同物種，樣點大小代表樣本數量（ Jin et al., 2018）。Tur紅色型二斑葉蟎、Tug綠色型二斑葉蟎、Ttr截形葉蟎、Tka神澤氏葉蟎、Tpu紅葉蟎、Tpi皮氏葉蟎、Tph豆葉蟎、Tma Tetranychus macfarlanei、Tlu盧氏葉蟎、Tev伊氏葉蟎
2. dsRNA如何引起基因的轉錄後沉默
2.1 RNA幹擾的發現及作用機制
外源基因導入抑制內部同源基因標的的現象最早是在牽牛花中被發現（Napoli et al., 1990），具體作用過程當時並不清楚。直到Fire等人將肌肉蛋白的反義鏈RNA和雙鏈RNA分別注射進秀麗隱杆線蟲，理清外源雙鏈RNA在線蟲體內沉默同源mRNA的過程，並稱之為RNA interference (Fire et al., 1998)。隨後，dsRNA介導的轉錄後基因沉默現象在多種植物、果蠅和真菌等中被發現(Waterhouse et al., 1998, Manika et al., 1999; Cogoni et al., 1999)。
dsRNA引起沉默效應的過程可分為3個階段：
（1）siRNA形成階段。當細胞內的dsRNA達到一定量後，具有內切酶活性的DICER對其特異性識別，將dsRNA裂解成大小為21～23nt的siRNA。
（2）RNAi效應階段。siRNA被沉默複合體（RNA-induced silencing complex，RISC）誘導並形成單鏈結構，單鏈特異性結合同源mRNA並對其進行切割。
（3）dsRNA擴增階段。以siRNA為引物，所結合的宿主mRNA為模板，在RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase, RdRP）作用下合成dsRNA。然後，新合成的dsRNA被切割成siRNA，繼續對靶mRNA進行剪切，如此過程循環往復，使轉錄的mRNA無法正常被翻譯成蛋白質，發揮功能(何正波et al., 2009; 周紅建et al., 2010)。
圖4 RNA幹擾的作用機制（周紅建et al., 2010）
2.2 RNA幹擾的運用
RNA幹擾可以分為細胞自主性和非細胞自主性兩種類型。細胞自主性產生的RNA幹擾範圍有限，僅限於含有dsRNA的細胞；非細胞自主性可以吸收體外的dsRNA，使環境中的dsRNA進入昆蟲體內，導致昆蟲的基因表達受到抑制。如此，將特定的外源dsRNA導入昆蟲體內，可以實現對昆蟲特定基因進行幹擾，調控昆蟲的生長。2006年，Araujo等通過人工飼餵法在長紅獵蝽的飼養食物中添加NP2基因的dsRNA，結果顯示長紅獵蝽體內NP2基因表達量顯著性降低（Araujo et al., 2006）。Chen等運用顯微注射法將幾丁質合成酶基因的dsRNA導入甜菜夜蛾中，發現實驗組甜菜夜蛾幾丁質合成受阻，相比對照組死亡率更高（Chen et al., 2010）。此外，RNA幹擾也可被用來保護益蟲，例如通過給蜜蜂飼餵致病病毒重要基因的dsRNA，抑制病毒的擴繁（Hunter et al., 2010）。目前，通過飼餵、人工注射和植物表達dsRNA等RNA幹擾方法已被廣泛運用於鱗翅目、膜翅目和雙翅目等昆蟲。
3. dsRNA導入葉蟎的方法
對昆蟲的靶基因進行沉默時，將外源dsRNA有效地導入昆蟲體內十分關鍵。在眾多的導入方法中，注射法能夠直接將一定體積的雙鏈RNA導入到昆蟲的特定組織中，也能在一定程度上避免dsRNA在體外降解，高效且常用。但是，受限於蟲子大小，目前注射法在葉蟎中難以實現。
3.1 葉碟飼餵法
葉碟法是讓葉片吸收dsRNA，然後讓葉蟎取食葉片，使dsRNA隨植物汁液進入葉蟎體內，具體操作如圖5 。首先用封口膜（parafilm）拉一層薄膜置於下層，在薄膜上加150μl 濃度為160 ng/μl 的dsRNA，在dsRNA上覆蓋豆葉。溶液從葉緣被吸入葉片，理論上處理時間越久則葉片內dsRNA含量越高，但處理24h後dsRNA含量幾乎達到峰值，此時讓葉蟎取食效果較好。葉蟎取食24~96h後，基因表達量較對照降低30%~50% (Kwon et al., 2013)。
圖5 葉碟法示意圖( Kwon et al., 2013)
3.2 葉碟飼餵法改進版
葉碟法的改進版是將葉片完全浸泡在含dsRNA的溶液裡，然後讓葉蟎在葉面取食。改進版的操作是把豆葉剪成小片（如邊長為1.5cm的方形葉片）後放在60℃的烘箱中脫水3min，然後用含dsRNA（1000ng/μl）的溶液浸泡處理5h，這樣能極大地促進葉片吸收dsRNA。隨後將葉片放在溼濾紙上，在每個葉片上挑飢餓處理24h後的30頭雌成蟲（成蟲3~5日齡），飢餓處理能夠讓蟲子在短時間內大量取食，獲得dsRNA。西南大學植物保護學院何林教授團隊利用該方法進行葉蟎的適合度和抗藥性等相關基因功能的研究，並已發表多篇SCI文章。另外，在取食48小時後，葉蟎基因表達量較對照能降低40%~60%( Shi et al., 2016; Zhang et al., 2018; Ma et al., 2019)。
3.3 浸泡法
浸泡法是將體外合成的dsRNA和表面活性劑等配製成一定濃度溶液，然後把昆蟲完全浸泡在溶液中一段時間，讓蟲體充分吸收體外的dsRNA。Suzuki等對比了葉片懸浮法、拉膜取食法和葉面殘留法等多種方法，結果顯示直接浸泡的方法效率最高，基因表達量較對照降低40%~50%（Suzuki et al., 2017）。將25隻剛孵化的幼蟲或50隻剛孵化的雌成蟲分別浸泡在25μl和50μl的dsRNA溶液（1300 ng /μl ; 0.1％ v / v Tween 20）中，在 20℃條件下浸泡2h（幼蟎）或24h（成蟎）。將浸泡處理後的存活蟎蟲轉移到豆葉上，將豆葉放置在培養皿的溼潤海綿上，並在26℃、16：8（L：D）光周期和50％相對溼度下培養。
3.4 植物表達dsRNA
植物自身如何才能表達針對昆蟲基因的特異性dsRNA呢？這就需要藉助轉基因技術了。首先，需要從害蟲體內克隆出候選基因的mRNA部分片段。隨後，用克隆得到的片段構建dsRNA植物表達質粒。然後，通過電擊轉化法把質粒導入根癌農桿菌。最後，用含根癌農桿菌的複合物處理植物種子，待植物生長時質粒表達，體內合成dsRNA對害蟲目的基因進行幹擾（Luo et al., 2010; Shen et al., 2017）。
展望
目前RNA幹擾技術已較為成熟地被應用到葉蟎的相關研究中。除此之外，基因編輯（CRISPR-Cas9）技術在葉蟎中已有成功的案例（Dermauw et al., 2020），但是顯微注射在葉蟎中運用仍不夠成熟。dsRNA介導的基因轉錄後沉默特異性強、簡單易行，且相較於基因編輯所需周期短，適用於單個或一類基因功能的研究。因為長期以來使用農藥進行防治，葉蟎的抗藥性急劇增加，利用轉基因植物表達dsRNA防治葉蟎具有一定的應用前景。但是目前轉基因糧食作物在我國的推廣種植時機還不成熟。此外，葉蟎中導入外源dsRNA介導的RNA幹擾效率相較於其他昆蟲較低，有待於在後續研究中得到提高。
參考文獻
1. Araujo R N, Santos A, Pinto F S, et al. RNA interference of the salivary gland nitrophorin 2 in the triatomine bug Rhodnius prolixus (Hemiptera: Reduviidae) by dsRNA ingestion or injection[J]. Insect Biochemistry and Molecular Biology, 2006, 36(9):683-693.
2. Cogoni C, Macino G. Gene silencing in Neurospora crassa requires a protein homologous to RNA-dependent RNA polymerase [J]. Nature, 1999, 399(6732):166-9.
3. Dermauw W , Jonckheere W , Riga M , et al. Targeted mutagenesis using CRISPR-Cas9 in the chelicerate herbivore Tetranychus urticae[J]. Insect Biochemistry and Molecular Biology, 2020, 120:103347.
4. Fire A, Xu S, Montgomery M K, et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans [J]. Nature, 1998, 391(6669).
5. Hunter W， Ellis J， vanEngelsdorp D, et al. Large-scale field application of RNAi technology reducing Israeli acute paralysis virus disease in honey bees ( Apis mellifera， Hymenoptera: Apidae) [J]. PLoS Pathog，2010. 6(12): e1001160
6. Jin P-Y, Tian L, Chen L, Hong X-Y. Spider mites of agricultural importance in China, with focus on species composition during the last decade (2008–2017) [J].Systematic and Applied Acarology, 2018, 23:2087–2098.
7. Kwon D H, Park J H, Lee S H. Screening of lethal genes for feeding RNAi by leaf disc-mediated systematic delivery of dsRNA in Tetranychus urticae [J]. Pesticide Biochemistry and Physiology, 2013, 105(1):69-75.
8. Luo M, Xiao Y, Li X, et al. GhDET2, a steroid 5alpha-reductase, plays an important role in cotton fiber cell initiation and elongation [J]. The Plant Journal, 2010, 51(3):419-430.
9. Ma X, Zhang Y, Zhou H, et al. Silencing T-type voltage-gated calcium channel gene reduces the sensitivity of Tetranychus cinnabarinus (Boisduval) to scopoletin [J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology and Pharmacology, 2019, 227:108644.
10. Manika, Pal-Bhadra. Cosuppression of Nonhomologous Transgenes in Drosophila Involves Mutually Related Endogenous Sequences [J]. Cell, 1999.
11. Napoli C, Lemieux C, Jorgensen R, et al. Introduction of a Chimeric Chalcone Synthase Gene into Petunia Results in Reversible Co-Suppression of Homologous Genes in trans [J]. The Plant cell, 1990, 2(4).
12. Shen G M, Song C G, Ao Y Q Y, et al. Transgenic cotton expressing CYP392A4 double-stranded RNA decreases the reproductive ability of Tetranychus cinnabarinus [J]. Insect Science, 2017, 24(004):559-568.
13. Shi L , Wei P , Wang X , et al. Functional Analysis of Esterase TCE2 Gene from Tetranychus cinnabarinus (Boisduval) involved in Acaricide Resistance [J]. entific Reports, 2016, 6:18646.
14. Suzuki T, Nunes M A, María U E, et al. RNAi-based reverse genetics in the chelicerate model Tetranychus urticae: A comparative analysis of five methods for gene silencing [J]. Plos One, 2017, 12(7):e0180654.
15. Tang B，Chen J，Yao Q，et al. Characterization of a trehalose-6 -phosphate synthase gene from Spodoptera exigua and its function identification through RNA interference [J]. Insect Physiol, 2010, 56 (7):813—821.
16. Waterhouse P M, Graham M W, Wang M B, et al. Virus resistance and gene silencing in plants can be induced by simultaneous expression of sense and antisense RNA [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1998.
17. Zhang Y, Feng K, Hu J, et al. A microRNA-1 gene, tci-miR-1-3p, is involved in cyflumetofen resistance by targeting a glutathione S-transferase gene, TCGSTM4, in Tetranychus cinnabarinus [J]. Insect Molecular Biology, 2018.
18. 何正波, 陳斌, 馮國忠. 昆蟲RNAi技術及其應用[J]. 應用昆蟲學報, 2009, 46(004):525-532.
19. 洪曉月. 農業蟎類學[M]. 中國農業出版社, 2012
20. 周紅建,黃松,王雄偉.RNAi技術研究新進展[J].生物技術通報,2010(12):84-87.
相關文章
【奇文】改造後的共生菌可以激活蜜蜂免疫力並限制病原體
共生奇文 |寄生蜂控制昆蟲體內共生菌的多樣性
共生奇文 |多代農藥處理會改變寄生蜂的微生物菌群結構
如果你喜歡這篇文章，請長按二維碼關注我們吧！