作為國產基因捕獲技術的耕耘者，艾吉泰康®在過去幾年一直為用戶提供極致性價比的捕獲產品。目前，已有很多科研工作者使用艾吉泰康®的產品發表了高水平論文。最近，艾吉泰康®的TargetSeq®技術助力用戶論文發表在《Science Translational Medicene》（IF 16.304）上。論文通過藥敏試驗、基因篩選、細胞生物學實驗等多種手段，揭示了PTEN基因在蛋白酶體活性方面的生理作用，為蛋白酶體抑制劑的抗癌治療提供了精準用藥的指導。艾吉泰康®承擔了論文中的PTEN基因全長序列的捕獲測序工作。全文較長，小編提煉了主要的研究結果，供大家快速了解這篇文章的研究內容。
高通量測序和靶向用藥已經為腫瘤治療提供了顯著的治療水平的提升。然而，只依靠測序和靶向藥，仍然無法精確預測藥物的治療效果。來源於患者的腫瘤異體移植模型（PDX），和PDX來源的腫瘤細胞（PDC）可以為個體患者的藥效檢測提供理想的檢測平臺。膽管癌（cholangiocarcinoma，CCA）是一種上皮細胞惡性增生的腫瘤，具有較顯著的異質性，臨床上採用的綜合性化療方案效果通常較差。尋找有效的治療方案是臨床上緊迫的需求。
作者首先構建了34個CCA的PDX模型。切片染色和細胞培養結果證實PDX模型和原腫瘤組織高度一致。隨後，作者使用10個模型的細胞對69種FDA批准的抗癌藥物進行了測試，發現bortezomib（硼替佐米）和carfilzomib（卡非佐米）具有顯著的抑制效果（圖一）。為了確定其他蛋白酶體抑制劑是否有同樣的效果，作者又檢測了其他45種，發現只有針對核心20S蛋白酶體的抑制劑有類似的效果。使用其他細胞進行檢測，發現bortezomib，carfilzomib和epoxomicin（環氧酶素）對HuCCT1有顯著作用，而epoxomicin和bortezomib對HCCC-9810細胞效果明顯。所有對bortezomib敏感的細胞均有蛋白降解活性上升和蛋白酶體相關基因表達上升的現象。圖一 藥物測試結果通過檢測HCCC-9810和RBE兩個有代表性的細胞系樣本的表達情況，作者發現PI3K-AKT和泛素介導的蛋白降解兩個通路在bortezomib敏感的HCCC-9810細胞中顯著上調。全基因組測序數據顯示HCCC-9810細胞在10號染色體上存在缺失，而PTEN基因恰好落在缺失的位置。通過對CCA樣本和細胞系的檢測，發現了PTEN基因的多種形式的變異（圖二）。根據基因檢測結果，可以將CCA分為三種類型：野生型（PTEN表達、功能正常），半合子型（表達、功能減弱）和缺失型（表達、功能缺失）。PTEN基因專一地出現在bortezomib敏感型細胞系中，這些細胞系也同時有蛋白酶體活性上升和蛋白質合成速度加快的特點。圖二 40個CCA相關樣本中PTEN基因的突變情況既然PTEN基因功能不完整的細胞系都存在對蛋白酶體抑制劑敏感的現象，那如果在細胞中過表達PTEN基因，效果如何呢？作者在HCCC-9810和RBE細胞中進行了腺病毒介導的PTEN基因超表達。和預期一致，PTEN基因有缺陷的HCCC-9810細胞表現出了細胞增殖速度降低進而凋亡的現象，而PTEN基因功能完整的RBE細胞的變化比較輕微。在活體腫瘤中超表達PTEN，PTEN本身有功能缺陷的腫瘤表現出了生長減緩，而PTEN完整的腫瘤沒有這個現象。這表明PTEN基因的功能缺失導致了腫瘤細胞的快速增殖。轉錄組數據表明HCCC-9810的蛋白酶體和泛素介導的蛋白降解途徑受到了影響。這個結論也得到了qPCR和蛋白質印記實驗的支撐。對PTEN基因野生型細胞、功能缺失細胞做PTEN基因過表達，發現蛋白酶體活性和蛋白質降解水平降低了。對PTEN野生型細胞做PTEN基因的敲除，可以看到蛋白酶體活性上升。這表明PTEN基因是抑制蛋白酶體活性和蛋白降解的。而野生型細胞中PTEN表達降低後，對bortezomib變得敏感了，這和PTEN缺陷型細胞對bortezomib的敏感是一致的。這些數據表明PTEN的功能和蛋白酶體活性/bortezomib敏感型是負相關的。小鼠活體模型和病人的臨床用藥監測也顯示了良好的抗腫瘤效果。圖三 bortezomib對PTEN功能正常和缺陷的腫瘤細胞的抑制效果PTEN影響藥物效果的機制是怎樣的呢？已知NRF1和NRF2是蛋白酶體相關基因的調節因子，過表達這兩個調節因子，促進了ARE報告子的表達和蛋白酶體的活性加強。而改變PTEN的表達後，NRF1和NRF2所受影響很小。這說明PTEN的功能和NRF1和NRF2彼此之間沒有影響。既然PTEN不影響已知的兩個蛋白酶體相關調控因子，那就需要尋找相關的基因。作者敲低了ARE相關的轉錄因子，發現BACH1和MAFF兩個基因相關。BACH1和MAFF的表達趨勢和PTEN的表達趨勢是一致的。BACH1是一個泛素因子，但缺乏典型的轉錄激活域。MAFF和CNC家族轉錄因子形成異源二聚體時，起轉錄激活的作用；MAFF的同源二聚體則起轉錄抑制作用。過表達PTEN可以促進BACH1和MAFF的表達升高。對BACH1和MAFF的啟動子進行單獨研究，發現PTEN的過表達可以提高BACH1和MAFF的啟動子的活性。這種提升是通過抑制AKT1的活性實現的。通過對細胞添加PI3K-AKT抑制物（MK2206），發現BACH1和MAFF的表達產物、蛋白質積累都有上升。ChIP實驗確認BACH1和MAFF可以結合到蛋白酶體相關基因的ARE序列，而ARE序列恰好在蛋白酶體相關基因的啟動子區。BACH1和MAFF對ARE介導的蛋白酶體相關基因表達是負調控的。圖四 ARE對BACH1、MAFF表達的影響BACH1和MAFF的表達變化情況是否會影響腫瘤細胞對bortezomib的敏感度呢？通過過表達和敲低實驗，證實BACH1和MAFF的表達水平和細胞對bortezomib的敏感度呈負相關，這和PTEN的表達水平和藥物敏感度是一致的。總體而言，PTEN水平降低，蛋白酶體活性升高，ARE轉錄活性升高，BACH1和MAFF水平降低。反之亦然。既然提高PTEN基因的表達和抑制PI3K-AKT都會引發BACH1和MAFF的轉錄增強，那麼是否有其他的調控因子存在呢？作者通過JASPAR資料庫，發現FOXO蛋白家族可以結合在BACH1和MAFF的啟動子區域，恰好AKT可以抑制FOXO。利用ChIP實驗，確認FOXO1可以和BACH1和MAFF的啟動子區域結合。敲低FOXO1和FOXO3均可以降低BACH1和MAFF的表達，但只有FOXO1可以逆轉PTEN過表達的影響。PTEN可以促進FOXO1在BACH1和MAFF啟動子上的結合，進而促進表達。圖五 FOXO蛋白家族在BACH1和MAFF基因啟動子的結合motif 結合之前的研究，作者構建了PTEN的作用模型：PTEN可以促進FOXO1在BACH1和MAFF啟動子上的結合，進而促進BACH1和MAFF表達。BACH1和MAFF可以抑制蛋白酶體的活性，減少蛋白的降解速率。突變的PTEN引發了BACH1和MAFF功能減弱，從而使蛋白酶體降解蛋白的活性增強。Bortezomib等抑制劑通過降低蛋白酶體的活性，引發細胞內待降解蛋白的沉積，產生蛋白毒性，進而導致細胞死亡。解析PTEN基因的作用機理後，作者最後檢查了蛋白酶體抑制劑在別的癌種的臨床效果。在血液和泌尿系統的腫瘤中，PTEN基因的功能狀態對腫瘤的影響不大，而在卵巢癌、前列腺癌中效果明顯。這意味著PTEN基因在多個癌種中是可以調節腫瘤細胞對蛋白酶體抑制劑的敏感度的。圖六 攜帶不同PTEN基因變異的細胞系對botrezomib的敏感差異好啦，以上就是論文的簡單梳理。全文很長，各種圖表也很多，老師們真的是做了非常多的工作才發表了這篇文章。艾吉泰康®會持續為科研工作者提供精準優質的捕獲服務~艾吉泰康 ( iGeneTech ) 生物科技（北京）有限公司，是坐落於北京市中關村生命科學園的高新技術企業，專注於基因檢測上遊的目標區域基因捕獲技術研發與創新。艾吉泰康依託液相探針雜交( TargetSeq® )和多重PCR擴增( MultipSeq® )兩套自主智慧財產權的捕獲技術，形成了包含基因捕獲試劑與試劑盒、捕獲服務解決方案、合成生物學的多元化產品體系，致力於不斷推進靶向捕獲技術在精準醫學、科研、大健康、農業、公衛和法醫等多場景中的轉化與應用。歡迎訪問艾吉泰康®
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