Neuron|剪接體基因突變可導致嬰幼兒早發性神經退行性疾病

2020-11-29 BioArt生物藝術

神經退行性病變(Neurodegeneration)不僅會在成年人中出現，在一些病例中，神經元的退變也可以出現在嬰幼兒期甚至是胚胎期。腦橋小腦發育不全( pontocerebellar hypoplasia, PCH) 就是這樣一組常染色體隱性遺傳的神經退行性疾病【1】。PCH具有表型的多樣性，其共同特徵包括腦橋小腦發育不全、萎縮以及運動障礙。其中部分患者出生後會表現出進行性加重的小頭畸形和不同程度的腦室擴大、嚴重的認知障礙以及癲癇。此外，PCH也有遺傳的異質性，目前研究發現了多個基因的突變可以致病，這些基因主要集中在幾個通路上，包括DNA修復、蛋白質翻譯、線粒體功能以及細胞的基礎代謝等【2】。

哺乳動物的絕大多數基因都含有至少一個內含子，而且絕大部分多外顯子(multi-exon)基因都會發生可變剪切。正確的RNA剪切對於基因的表達是必須的，這是細胞信息流從轉錄到翻譯的重要中間步驟。在細胞內，RNA的剪切是由一個由多個蛋白和小RNA分子組裝成的RNA剪切體（spliceosome）實現的【3】。RNA剪切體需要在pre-mRNA上經過多步組裝形成成熟的複合體，最終完成剪切反應：剪掉內含子、連接外顯子，最後生成攜帶有連貫信息的成熟mRNA。之前的研究主要集中在單個基因的剪切位點突變通過幹擾RNA剪切而導致疾病，而編碼RNA剪切體的組分基因突變導致人類疾病卻很少被報導【4】。

2020年11月20日，美國加州大學聖地牙哥分校Joseph Gleeson課題組和英國利茲大學Eamonn Sheridan課題組合作在Neuron上發表了題為Mutations in Spliceosomal Genes PPIL1 and PRP17 Cause Neurodegenerative Pontocerebellar Hypoplasia with Microcephaly的研究論文，首次報導了編碼RNA剪接體組分的基因亞效突變也可以導致這類神經退行性病變，並且揭示了一個脯氨酸異構酶在RNA剪切體中主要發揮支架蛋白而非催化酶的作用。

該研究首先通過全外顯組或全基因組測序，在10個不同的家系裡的18例患有腦橋小腦發育不全並伴隨小腦畸形的病人中鑑定出PPIL1或PRP17基因的純合（homozygous）或者複合雜合(compound heterozygous)突變。這些病人大多都伴隨癲癇症狀，並且一部分病人在出生後的幾個月內死亡。PPIL1和PRP17都編碼RNA剪切複合體的組分，它們在RNA剪切反應開始之前被募集到成熟前複合體中，並一直作用到剪切反應結束。體外實驗發現病人的突變或影響蛋白的穩定性，或影響其與其他剪切複合體蛋白的相互作用。

圖1. PPIL1的隱性突變可以導致PCH

PPIL1在小鼠胚胎中廣譜表達。完全敲除PPIL1或PRP17的小鼠呈現出早期胚胎致死的表型，而兩種PPIL1病人點突變敲入（knockin）的純合突變（homozygous mutants）小鼠可以存活到出生，並且表現出與病人類似的表型。在胚胎期，突變小鼠的腦中可以觀察到大量神經元細胞特異性凋亡，並且伴隨著神經幹細胞數量的減少。

圖2.

接下來作者嘗試探究PPIL1和PRP17對於RNA剪切是否是必須的。研究發現缺少PPIL1的細胞和腦組織都有大量基因可變剪切的改變。與對照相比，在胚胎期的突變體大腦組織中，作者一共發現了3797個顯著的可變剪切變化，涵蓋了2314個基因。生物信息學分析發現顯著改變的RNA剪切主要集中在長度短、GC含量高的內含子上，或者是在弱的剪切位點上。功能和通路富集分析顯示剪切顯著改變的基因主要與細胞的基礎生命代謝相關，包括了蛋白翻譯和DNA修復等。缺少PRP17的細胞也表現出RNA剪切和細胞增殖的缺陷，而表達病人的突變蛋白並不能夠逆轉這一變化。

PPIL1編碼一種脯氨酸異構酶，這種酶可以催化含有脯氨酸的肽鍵（X-Pro）順式和反式的變化速度，從而能夠促進底物蛋白的構象變化。在RNA剪切反應中，一共有八個不同的脯氨酸異構酶被募集到剪切複合體中【5】。但是，它們的底物蛋白是什麼，以及它們是不是通過發揮催化功能來調控剪切反應仍然不清楚。

作者接下來嘗試研究PPIL1調控剪切的功能機制。在多個RNA剪切體的cyro-EM結構中【6】，作者發現PPIL1的酶活中心能夠結合PRP17蛋白的Gly94-Pro95肽鍵，並且體外實驗發現PPIL1可以催化PRP17肽鍵構象的變化，從而證明了RNA剪切複合體中第一對脯氨酸異構酶和其底物蛋白。

圖3

最後，作者探究PPIL1作用於PRP17的催化功能對於RNA剪切和大腦發育是不是必須的。有意思的是，在細胞和小鼠中，不管是導致PPIL1酶活失活的突變(Arg55Ala)還是破壞掉PRP17 Gly94-Pro95的突變(Pro95Ala)都沒有導致任何神經凋亡的上調，大腦發育的缺陷，或者RNA剪切的變化。這些結果說明PPIL1在RNA剪切體中主要行使支架蛋白作用。

綜上，該研究發現編碼RNA剪切體核心蛋白組分的基因的部分功能缺失可以引起大量基因的可變剪切變化，並導致神經元的大量凋亡。這一研究第一次將RNA剪切複合體功能缺陷與人類小腦畸形和腦橋小腦發育不全疾病聯繫起來。此外，該研究也揭示了一種脯氨酸異構酶在RNA剪切體中主要發揮支架蛋白而非催化的功能。

原文連結：

https://doi.org/10.1016/j.neuron.2020.10.035

參考文獻

1.Cassandrini D, Biancheri R, Tessa A, et al. Pontocerebellar hypoplasia: clinical, pathologic, and genetic studies. Neurology2010;75:1459-64.

2.Synofzik M, Puccio H, Mochel F, Schols L. Autosomal Recessive Cerebellar Ataxias: Paving the Way toward Targeted Molecular Therapies. Neuron2019;101:560-83.

3.Shi Y. Mechanistic insights into precursor messenger RNA splicing by the spliceosome. Nat Rev Mol Cell Biol2017;18:655-70.

4.Singh RK, Cooper TA. Pre-mRNA splicing in disease and therapeutics. Trends Mol Med2012;18:472-82.

5.Rajiv C, Davis TL. Structural and Functional Insights into Human Nuclear Cyclophilins. Biomolecules2018;8.

6.Zhan X, Yan C, Zhang X, Lei J, Shi Y. Structure of a human catalytic step I spliceosome. Science2018;359:537-45.

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