來源：澎湃新聞
原標題：知名愛滋研究團隊構建新冠突變預警系統：一突變株在全球流行
作為RNA病毒，新冠病毒在傳播中被認為容易發生變異。科學家通過近兩個月的追蹤發現，截至目前，新冠病毒的S蛋白（刺突糖蛋白）中出現了13個正在積累的突變，其中一種突變病毒株正佔據主導優勢。S蛋白是新冠病毒進入人類細胞的「鑰匙」，也是眼下大多數疫苗策略和以抗體為基礎的治療的靶標。
以上發現來自知名的美國洛斯阿拉莫斯國家實驗室（Los Alamos National Laboratory）、杜克人類疫苗研究所和外科系、英國謝菲爾德大學等團隊的研究人員於當地時間5月5日發表在預印本平臺bioRxiv發上的一項研究：「Spike mutation pipeline reveals the emergence of a more transmissible form of SARS-CoV-2 」。
研究的通訊作者、第一作者為洛斯阿拉莫斯國家實驗室的計算生物學家Bette Korber，主要研究愛滋病病毒的分子生物學和種群遺傳學，為獲得有效的愛滋病毒疫苗作出了重大貢獻，其中一種目前正在非洲進行人體試驗。2004年，Korber曾獲得歐內斯特·奧蘭多·勞倫斯獎（Ernest Orlando Lawrence Award），該獎是是美國能源部頒發的對科學成果最高認可的獎項。
研究團隊開發了一種分析軟體（analysis pipeline），用以實時跟蹤SARS-CoV-2中的突變。他們認為，在更廣泛的系統發育背景、地理位置和時間上考慮突變，可以提供一個「早期預警系統」，以揭示突變可能在傳播或對幹預措施產生抗性方面帶來的選擇性優勢。
論文中寫道，研究團隊追蹤到的其中一種突變病毒株S蛋白D614G突變的研究迫在眉睫，它於2月初開始在歐洲傳播，當它出現在一個新的地區後，很快就會成為主要傳播毒株。這種或始於歐洲的突變毒株或是全球疫情大流行的重要推手。此外，研究團隊證實，毒株之間會發生重組，提示多重毒株感染。這些發現對SARS-CoV-2的傳播、發病機制和免疫幹預具有重要意義。
不過，也有觀點表達了對上述結論的質疑，認為這項尚未經同行評議的研究需謹慎對待。質疑者提出，現在就判斷任何一種毒株更具傳染性都為時過早。一些人甚至提出，G614（研究後期）突變病毒株之所以傳播得如此之深遠和廣泛，是因為它恰好感染了在大流行最初階段沒有採取措施的地區。或許研究者還需要做更多的工作來確定是否有任何毒株比其他毒株更具傳染性，以及確定病毒的變異速度是否可能超過疫苗的研發速度。
「這裡有很多猜測，他們沒有經過實驗驗證。」休斯頓德克薩斯兒童醫院疫苗開發中心的Peter Hotez博士表示。
哈佛大學陳曾熙公共衛生學院的Bill Hanage博士則認為，單點突變不太可能產生任何影響。Hanage寫道，重要的是要記住，任何藥物或疫苗都要經過測試，以對抗正在傳播的任何一種病毒。「病毒能這麼早地在所有這些疫苗上找到逃逸突變，那就太幸運了。」他還認為，由於幾乎沒有人對該病毒有任何自然免疫，因此幾乎沒有或根本沒有導致逃逸突變的選擇壓力。
當然，Korber領銜的這支研究團隊在論文中強調，鑑於S蛋白在病毒感染性和作為抗體靶標方面的重要性，迫切需要通過「早期預警」來評估S蛋白進化。這項研究的主要目的是識別突變的動態變化模式，此外，基於重組是冠狀病毒進化的一個重要方面，研究團隊也嘗試確定重組是否在SARS-CoV-2疫情演變中發揮作用。
迫切需要通過「早期預警」來評估S蛋白進化
論文提到，儘管目前觀察到的SARS-CoV-2序列多樣性較低，但它的快速傳播為病毒提供足夠的機會來進行自然選擇，從而產生較少但對其自身有利的突變。這和流感的情況類似，在整個流感季節內病毒都會在血球凝集素蛋白（HA）上緩慢積累突變。「SARS-CoV-2對我們來說是新的，我們還不知道它是否會隨著天氣變暖和溼度增加而季節性地減弱，但我們缺乏免疫力，以及它相對於流感具有更高的傳播能力，這些可能是它不會減弱的原因。」
必須要考慮的一種糟糕情況是，如果疫情未能消退，在第一支疫苗出現之前的一年或更長的時間裡，抗原漂移（antigenic drift）和人群中與免疫相關的突變積累會更加惡化疫情大流行。所謂的抗原漂移，指的是病毒通過改變自己的基因，讓蛋白的序列和結構改變，從而使得原本有免疫力的人識別不了。
研究團隊認為，這種擔憂是合理的，現在關注這一風險可能能夠抓住病毒的重要進化轉變，「如果忽視這一轉變，可能最終使得第一批疫苗在臨床使用中的有效性打折。」
目前，全球針對SARS-CoV-2的疫苗大多靶向S蛋白，從而獲得保護性的中和抗體。S蛋白介導病毒和宿主細胞結合併入侵，它由S1結構域和S2結構域兩部分組成，分別介導受體結合和膜融合。而由於疫情持續時間還沒有足夠長到進行SARS-CoV疫苗的有效性試驗，因此我們目前缺乏有助於指導SARS-CoV-2疫苗開發的關鍵信息。
在過去兩個月的時間裡， 洛斯阿拉莫斯國家實驗室愛滋病毒資料庫團隊轉向了新冠研究，他們將「全球共享流感數據倡議組織」（GISAID）資料庫中SARS-CoV-2序列數據作為基準，開發了一項分析軟體（analysis pipeline）實時跟蹤SARS-CoV-2S蛋白的進化。該分析軟體（www.cov.lanl.gov） 由洛斯阿拉莫斯國家實驗室與杜克大學中和抗體評估小組合作開發。
值得注意的是，研究團隊觀察到，SARS-CoV-2序列之間的突變實際上還比較少，這限制了傳統的基於序列的方法來檢測正向選擇的適用性。然而，他們提出可以採用另一種分析框架來確定正向選擇，該框架基於GISAID資料庫，GISAID提供了與地理信息和採樣日期相聯繫的數千個序列的豐富資料庫。這使得通過識別隨時間變化的突變頻率的變化來跟蹤正向選擇的早期跡象位點成為可能。在這項研究中，研究團隊分析了GISAID資料庫中4535個（截至4月13日）完整的S蛋白序列。
由於S蛋白突變仍然是較少的，研究團隊設置了位點低閾值，被視作可進一步追蹤的「興趣位點」。因此，當在0.3%的序列中都發現了一種突變時，研究團隊開始通過研究其進化軌跡和建模其結構影響來跟蹤它，例如，它對抗體結合位點、三聚體穩定性和糖基化模式的潛在影響。
根據上述低閾值標準，研究團隊總共追蹤到13個位點，以及一個局部突變簇。論文詳細討論了一個特別值得關注的突變D614G，然後簡要總結了其他追蹤位點。他們最初開始注意到，「D614G的頻率正在以驚人的速度增加，這表明與最初的毒株相比，它具有適應性優勢，能夠更快地傳播。」
G614突變病毒株在全球成為主要流行毒株
突變D614G（武漢參考毒株23403位點的G-A鹼基變化）是研究團隊在3月初的第一次S蛋白突變報告中唯一追蹤到的位點突變；在當時可用的183個序列中，它被發現了7次。
這7個首批D614G突變病毒株中的4個在歐洲取樣，另外在墨西哥、巴西和武漢各取樣1個。其中5個毒株，D614G突變同時還伴有2種其他突變：nsp3基因3037位點的C-T突變，以及14409位點的C-T突變，導致RNA依賴RNA聚合酶（RdRp）胺基酸改變（RdRp P323L）。論文指出，這三種突變的組合形成了很快在歐洲出現的分支的基礎。歐洲最早的D614G突變則出現於德國（EPI_ISL_406862），採樣時間為1月28日，該病毒株同時在3037處有C-T突變，在14409處沒有突變。
在研究團隊3月中旬的第二份突變報告中，由於在GISAID出現的高頻率，D614G繼續被追蹤，並被稱為「G」分支。值得注意的是，全球29%的樣本中都有這種病毒，但幾乎只在歐洲發現。
3月中旬可供研究的數據顯示，採樣和報告之間大約有兩周的滯後時間，這與歐洲可能出現的「始祖效應」相一致，整個歐洲大陸隨後傳播範圍擴大，同時GISAID資料庫中歐洲採樣的數量也增加。
然而，來自4月初GISAID的數據顯示，G614突變株的頻率在整個3月以驚人的速度增長，而且清楚地看到其地理分布不斷擴大。
他們觀察到，幾乎在每一個有足夠採樣的地方都觀察到一種清晰一致的模式。即在大多數國家和州COVID-19流行開始的時候，也就是3月1日之前採樣序列顯示，D614突變株佔主導地位。但G614一旦在一個地方出現後，其在人群中就會快速快播，大多數情況下它在幾周之內就會成為該地區的主導病毒株。
在G614最初開始大面積擴散的歐洲，D614和G614在疫情早期共同傳播，不過除了義大利和瑞士，在大多數採樣國家中D614更為常見。在整個3月，G614在歐洲變得越來越常見，並在4月形成主導地位。
在北美，最初的感染主要為D614形式，但在3月初，加拿大和美國均出現了G614，並在3月底前成為這兩個國家的主要病毒形式。華盛頓州是美國在GISAID資料庫中可用SARS-CoV-2序列最多的州，它例證了上述模式，隨著時間的推移，其他許多州也明顯出現了類似的變化。紐約採樣方面比較匱乏，直到3月開始有序列上傳，並且G614已經是主要形式。彼時，G614的形式在美國的其他地方也變得突出。
針對歐洲和北美的情況，研究團隊認為，目前尚不清楚地方大流行是否是由歐洲接觸者「播下種子」，還是由已獲得高流行的美國接觸者「播下種子」，或者是這兩種路徑的結合。
澳大利亞也和美國、加拿大一樣，從D614主導向G614主導過渡。
冰島則是唯一的例外，冰島進行了廣泛的檢測，疫情流行似乎開始於G614形式，但有一個短暫的D614增加，但隨後持續處於恆定的低水平。
亞洲樣本完全由武漢最初檢測到的D614形式佔據主導，但到了3月中旬，G614在中國以外的亞洲國家形式顯然建立和擴散了。另外，需要注意的是，由於3月1日之後，隨著疫情在中國的逐漸平息，很少有來自中國的序列上傳到GISAID，中國的D614G突變狀況尚不清楚。
此外，南美洲和非洲的樣本仍然很少。
綜上所述，研究團隊認為，數據顯示G614具有選擇性優勢，在各區域大流行中均出現在幾周內發生D614主導向G614主導的轉變反映了這一點。
研究團隊還提到，G614分支病毒在中國的早期樣本中也發現了4次。2月7日採樣的一個來自武漢的序列（EPI_ISL_412982）有D614G突變，但沒有同時出現其他兩種突變，他們推測這一單一的D614G突變可能是獨立出現的。
其餘三例則可能與德國序列有關。在1月24日採樣的一個序列來自浙江（EPI_ISL_422425），它具有與在歐洲擴散的G分支相關的所有三個突變。另外兩個樣本均來自上海，分別於1月28日和2月6日採樣（EPI_ISL_416327， EPI_ISL_416334），和德國的序列一樣，它們在14409處沒有出現突變。
研究團隊認為，考慮到這些早期的來自中國的序列在整個基因組中與德國的序列也高度相關，目前全球大流行的G614可能起源於中國，但也有可能起源於歐洲，因為它在1月底在這兩個區域均出現。
另外目前沒有來自上海或浙江的近期GISAID序列，所以研究不清楚G614在上海是否有選擇優勢，但1月和2月初的時候D614在上海流行。
攜帶G614突變患者具有較高病毒載量，但並沒有顯著加重病情
D614G適應性增強背後的潛在機制是什麼？研究團隊提出，有兩個不同的概念框架可以解釋為什麼D614G突變與增加的傳播有關。
第一個是基於結構。D614位於S蛋白原聚體的表面，可以與相鄰的原聚體接觸。冷凍電鏡結構表明，D614的側鏈可能與相鄰原聚體的T859形成氫鍵。這種原聚體-原聚體氫鍵可能是至關重要的，它可以將一個原聚體的S1結構域的殘基和另一個原聚體的S2結構域結合。而D614G突變減少了S1和S2之間的相互作用，促進了S1和S2分離。這種突變也可能會影響RBD-ACE2的結合。然而，研究團隊強調，需要更詳細的試驗和建模研究來闡明這種突變對RBD轉變的影響。
D614G突變可能影響傳播的第二種方式是免疫。D614嵌入在原始SARS-CoV S蛋白的免疫顯性線性表位中。該肽具有很高的血清學反應活性（64%），並且在2002年SARS-CoV流行期間感染個體的恢復期血清中誘導了長期的b細胞記憶反應。無論是在體外還是在體內，針對這種肽的抗體都通過一個表位序列依賴機制介導了SARS-CoV感染的抗體依賴增強（ADE）。所謂的ADE，即指病毒在相應抗體協助下複製或感染能力顯著增強的現象。有研究推測，抗體結合可能介導了S蛋白的構象變化，從而增加了RBD-ACE2的相互作用，產生增強效應。
因此，基於現有的信息，研究團隊認為，D614G突變可能通過多種方式影響S的感染性：它可能提高受體結合、融合激活或ADE抗體誘導。另一種機制則可能僅僅通過抗原漂移介導抗體逃逸。
值得注意的是，改變後的S蛋白對早期中和抗體的敏感性可能也降低了，這可能使易感人群受到第二次感染。
研究團隊還考慮了另一個問題，如果D614G突變可以增加傳播能力，是否也可能影響疾病的嚴重程度？由於臨床結果數據在GISAID中無法獲得，研究團隊將重點放在一個單一的地理區域，即英格蘭的謝菲爾德。謝菲爾德遵循了世界上大部分地區觀察到的模式，起初為D614開始，到3月底主要轉向G614。他們研究了來自謝菲爾德的453名COVID-19患者。
結果顯示，與D614相比，攜帶G614突變的患者具有較高的病毒載量。但是這並不一定意味著疾病危險的增加，他們提到，雖然G614突變在ICU患者中略有富集，但這在統計學上並不顯著。