引言
生物列印領域在複雜性和功能性日益提高的工程組織方面取得了重大進展。然而，開發具有最佳生物相容性和良好印刷保真度的生物油墨仍然具有挑戰性。在這裡，我們證明了基於納米粒子（NPs）與 聚合物之間的動態共價鍵的聚合物基生物墨水的可印刷性得到了增強，並保留了良好的生物相容性。將呈胺態的二氧化矽納米顆粒（約45 nm）添加到含有氧化藻酸鹽（OxA）的聚合物油墨中。Oxa的 NP上的胺和醛之間的胺之間形成可逆的亞胺鍵，可顯著改善流變性和高印刷保真度。尤其是，屈服應 力隨NP含量的增加而增加（不使用NP時為14.5 Pa，使用2 wt％NP時為79 Pa）。此外，與離子交聯凝膠相比，凝膠中動態共價鍵的存在在7天內改善了機械穩定性。納米複合油墨保留了高印刷性和機械強度，導致生成了釐米級的多孔結構和帶有懸垂和高結構保真度的耳結構。此外，納米複合墨水同時支持含有軟骨細胞的生物列印凝膠的體外和體內成熟。這種基於簡單氧化的方法可以應用於任何多糖，因此該方法的廣泛應用有望推動該領域朝著精確生物印刷的目標發展。
近期，Marcy Zenobi-Wong團隊在IOPScience雜誌上發表了題為「納米複合生物墨水利用納米粒子和多糖之間的動態共價 鍵進行精確的生物印刷」的研究。網址為：https://orcid.org/0000-0002-8522-9909
01簡介
生物列印已顯示出巨大的潛力和潛力，因為它是一種生成3D組織構造的通用技術，該構造與多尺度和 多細胞結構以及天然組織的機械異質性非常相似。這種生物列印組織可以提供患者定製的移植物，體外藥物抗性測試系統以及具有高精度和再現性高通量藥物篩選平臺。載有細胞的構建體的製備可通過直接印刷帶有/不帶有支撐材料的細胞或將細胞接種在印刷的支架上來進行。前一種方法有利於實現高細胞密度，類似於天然組織的細胞連續分布以及不同細胞類型的精確定位。包含活細胞的墨水稱為「生物墨水」，它不同於由包含生物因子的水凝膠的聚合物或前體組成的生物材料墨水。具有高生物相容性和可印刷性的生物油墨的開發一直具有挑戰性，因為只有有限的材料，交聯 方法和加工條件才能在生物印刷後實現高細胞活力和功能。大多數傳統的水凝膠已顯示出良好的生物相容性，但印刷後的可印刷性，印刷保真度和/或機械穩定性較低。
圖1. （a）納米複合生物墨水的示意圖，該墨水基於SiNP與氧化多糖之間的動態共價亞胺 鍵，並通過生物墨水進行生物印刷。（b）使用高碘酸鈉作為氧化劑合成氧化藻酸鹽。（c） 未修飾的（Alg）和氧化的（OxA）海藻酸鹽的FTIR光譜。（d）本研究中使用的表面改性 SiNP的示意圖。
02評估可印刷性和印刷保真度
為了評估可印刷性，Polym和NC墨水使用了不同的印刷壓力，這是導致每種墨水連續連續擠出絲束且 斷裂不超過30s的最小壓力。在固定的印刷壓力下，分析了擠出絲條的穩定性和厚度（圖2（a））。對於兩種油墨，由於進料速度太高，在2 mm/s 印刷速度下擠出會導致線束結構定義不清。隨著在5 mm/s 處提高印刷速度，可以印刷寬度均勻的單股線。列印速度的進一步提高導致線寬減小。（圖 2（b），（c））在給定的列印速度下，NC墨水的線寬比Polym墨水的線寬更細。例如，在速度10毫米/時，NC和POLYM墨水的線寬度分別為397μ/m和522μ/m。對於這兩種油墨，以高於15mm/s 速度進行列印都會導致股線偶爾斷裂，這表明穩定的股線擠出範圍約為。5-10毫米/s 。因此，將10mm/s列印速度用於後續步驟。
圖2. 油墨的可印刷性和印刷保真度。（a）不同列印速度的列印線照片。比例尺=1毫米 （b），（c）使用Polym墨水（b）或NC墨水（c）列印的線寬。（d）具有不同間距的印刷網格結構的照片。（對於20％和30％填充，線束之間的距離分別為2 mm和1.3 mm。）比例尺= 1 mm（e）對於具有不同間距的網格結構，每種墨水的擴散率。P <0.001（f）具有支柱的結構上的印刷線束照片。比例尺= Polym墨水和NC墨水的2毫米（g）塌陷面積系 數，取決於柱之間的距離。（h）10層網格結構的照片。黃色框表示Polym鏈下垂，並且NC 鏈具有良好的跨接特性。比例尺= 5毫米（i）耳朵結構的照片。紅色框表示放大倍數。
03體外和體內生物相容性
評估生物列印的軟骨細胞的生物學活性。用Polym墨水或NC墨水對軟骨細胞進行生物列印，並在體外 培養28d。培養28天後，生物印染的細胞表現出細長的形態，而在第1天，大多數細胞在兩種凝膠中 均保持圓形（圖3（a））。使用從螢光染色獲得的圖像量化細胞活力（圖3（b））。在所有時間點， Polym凝膠和NC凝膠之間均未觀察到顯著差異。對於這兩種油墨，發現列印後即刻的生存能力約為。80％，略降至約在第28天時佔70％。免疫組織化學染色證實， 體外培養6周後，生物列印細胞沉積了 膠原蛋白（I型和II型）以及糖胺聚糖（GAG，Safranin O /快速綠色染色）（圖3（c），剩下）。除 了牛關節軟骨細胞外，生物墨水還支持通過生物列印的人耳軟骨細胞的基質沉積（圖3（c），右）。對於兩種細胞類型，陰性IgG對照均未觀察到陽性染色。
圖3 生物列印凝膠的體外成熟。（a）生物列印細胞的活/死染色圖像。Hoechst將所有核染色。（b）生物列印細胞的生存力（c）體外成熟6周後，使用牛關節軟骨細胞或人耳軟骨細胞將膠原I和II染色圖像以及糖胺聚糖（番紅O染色）沉積在生物列印凝膠中。比例尺= 100 μ 米。
最後，將生物列印的凝膠植入裸鼠的皮下口袋中（圖4（a））。體內成熟8周後，Polym和NC凝膠均保持其形狀和大小，表明該凝膠在更具挑戰性的環境中穩定（圖4（b））。重要的是，沒有一種凝膠允許血管向內生長，如無紅細胞的存在所證明，這種紅細胞在H＆E染色後顯示出明顯的櫻桃粉紅色。對於兩種凝膠，均證實了類似量的膠原蛋白I和II以及GAG的沉積，與膠原蛋白II相比，膠原蛋白I的染色相對更濃（圖4（C））。儘管NC凝膠的顏色比Polym凝膠的顏色更深，但凝膠的顏色既不會產生明顯的背景色也不會導致背景染色。另外，沒有誘導凝膠中的鈣化，這通過負茜素紅染色證實，這進一步突出了水凝膠的生物相容性和穩定性。
圖4. 生物列印凝膠的體內成熟。（a）小鼠皮下植入模型的示意圖（b）體內成熟8周後的生物列印凝膠（c）膠原I / II的免疫組織化學染色和糖胺聚糖的組織化學染色（番紅O /堅牢綠 色），鈣沉積（茜素）紅色，無陽性染色）和體內成熟8周後的生物列印凝膠的H＆E 。比例尺= 100 μ米。
04結論
Marcy Zenobi-Wong團隊證明了納米複合材料中NP與聚合物之間動態共價鍵的形成可以提供增強的機械性能和印刷保真度，而不會損害聚合物油墨的生物相容性。NC墨水中的亞胺鍵導致增強的剪切稀化特性以及增加的屈服應力，從而以高保真度實現了各種結構的3D列印，同時減少了墨水材料的擴散或塌陷。由於存在於 NPs表面上的伯胺具有增強的流變性，因此也可以使用由不同於二氧化矽的其他材料製成的存在胺的納米顆粒。此外，考慮到存在醛的生物聚合物（包括許多氧化多糖）的可用性。
參考文獻：
Lee, M., Bae, K., Levinson, C., & Zenobi-Wong, M. (2020). Nanocomposite bioink exploits dynamic covalent bonds between nanoparticles and polysaccharides for precision bioprinting. Biofabrication, 12(2), 025025.