撰文 | Qi
責編 | 兮
大多數動物都表現出外部雙側對稱性，但是體內往往存在多個器官（例如心臟）的左右不對稱分布（L-R asymmetries）【1】。在斑馬魚胚胎發育時期，左右對稱性的首次打破發生在Kupffer囊泡中（引導L–R發育的纖毛器官），隨後L–R信息通過生長因子Nodal的不對稱表達傳遞至到左外側板中胚層（left lateral plate mesoderm, LPM），進而導致大腦，心臟和其他結構的正確分布。如何確定胚胎發育過程中器官的偏側性（laterality）是一個非常有趣的問題，然而至今仍存在大量懸而未決的難題。
2017年，來自西班牙UMH-CSIC神經科學研究所的M. Angela Nieto課題組（下文簡稱為Ocaa等）在Nature 雜誌上發表了一篇題為「A right-handed signalling pathway drives heart looping in vertebrates」的文章【2】，該研究基於斑馬魚胚胎的LPM中配對樣同源盒轉錄因子（paired-like homeobox transcription factor）Prrx1a的瞬時右偏表達，使用針對prrx1a的剪接和翻譯阻斷劑嗎啉代寡核苷酸（morpholinos, MO1）來抑制其功能，報導注射這一阻斷劑的幼體出現心臟偏側缺陷。
此外，向斑馬魚胚胎注射single-guide RNA和cas9蛋白以誘導prrx1a發生體細胞突變，也同樣觀察到類似缺陷。因而得出結論，prrx1a在驅動心臟環化（cardiac looping）的新型右手型信號通路（right-handed signalling pathway）中的作用。
但是關於這篇文章的結論，來自南加州大學凱克醫學院的J. Gage Crump課題組和來自荷蘭皇家科學院Hubrecht研究所的Jeroen Bakkers課題組（以下簡稱為Tessadori等）提出了質疑，並於2020年9月23日於Nature雜誌上發表題為「Zebrafish prrx1a mutants have normal hearts」的文章【3】，表示沒有發現prrx1a在建立驅動斑馬魚心臟環化的右旋信號通路中的作用。
Tessadori等先前報導了分別通過TALENs和CRISPR–Cas9產生的prrx1a的兩種種系移碼突變（germline frameshift mutant）：prrx1ael558和prrx1ab1246，這些等位基因預計消除整個DNA結合域，類似於Ocaa等在研究中所使用的MO1的預期效果。然而，結果顯示發現prrx1ael558和prrx1ab1246在任何階段都未能導致明顯的形態缺陷，且僅與prrx1b突變等位基因結合才會導致顱面缺陷【4】。
隨後，Tessadori等也對斑馬魚胚胎注射MO1和sgRNA–Cas9，但是與Ocaa等人的結果相反，prrx1ael558和prrx1ab1246的純合突變體胚胎在受精後（post-fertilization, hpf）26小時時線性心管向左移位正常（稱為left cardiac「jogging」），在50 hpf時右旋心臟環化正常。
在prrx1ael558突變體中，心管形成之前LPM中lefty2（lft2）的表達也不受影響。Tessadori等認為心臟表型的缺失並不是由於旁系同源物prrx1b或母體提供的prrx1a所補償，因為在prrx1ael558 / el558; prrx1bel491 / el491雙重突變體和從純合突變體母體中獲得的prrx1ael558 / el558胚胎中，心臟環化同樣不受影響。
需要注意的是，儘管MO1和相關的反義試劑已被廣泛用於抑制許多脊椎動物的基因功能。在某些情況下，其導致的表型也未能在相應的純合功能喪失的斑馬魚突變體中觀察到，即使蛋白功能已被驗證完全喪失【5,6】。
接下來為了測試Ocaa等使用的prrx1a剪接阻斷劑MO1（prrx1a-MO1）的特異性，Tessadori等將其滴定並注入野生型胚胎中，並證實其報導的對心臟環化的效應。然而當將prrx1a-MO1注入prrx1ael558合子突變胚胎中，也能觀察到對心臟環化的相同影響，這表明觀察到的心臟偏側性缺陷可能不是由prrx1a的敲低引起的。類似的，當prrx1ael558 / el558和prrx1bel491 / el491雙突變體時也獲得了一致的結果。
對於MO1敲低表型與種系突變體中缺乏這種表型之間的原因，已經有多項研究給出解釋：1）MO1剪接的脫靶效應【7】；2）為響應MO1而激活的固有免疫反應【8】；3）通過改變的起始密碼子，核糖體移碼或改變的剪接在突變體中產生功能蛋白【9】；4）最明顯的是突變體中相關基因的上調,即「轉錄適應（transcriptional adaption）」【10】。
最近的報導表明，轉錄適應是由無義介導的編碼具有提前終止密碼子蛋白質的mRNA降解（Nonsense-mediated mRNA decay）觸發的【11】。因此，Tessadori等生成了三個新的prrx1a等位基因，包含阻止mRNA產生的大片段缺失。其中兩個突變體通過刪除TSS周圍的外顯子1和上遊序列（prrx1ahu13685和prrx1ahu13762）產生，另一個等位基因prrx1ael803則包含一個7kb片段的缺失，涵蓋TSS和所有外顯子，均排除prrx1a mRNA和蛋白質的產生。
這些大片段缺失等位基因的純合子胚胎在26 hpf時表現出正常的「cardiac jogging」，在50 hpf時表現出右旋心臟環化。因此，這一結果提示突變體mRNA介導的轉錄適應並不能解釋MO1誘導表型與種系突變表型之間的差異。此外，將prrx1a-MO1注入缺乏prrx1a-MO1靶位的prrx1ahu13685 / hu13685突變體中，同樣會在心臟環化中存在缺陷，進一步證實了其缺乏特異性。
為了更深入地了解MO1誘導的心臟環化缺陷的可能原因，Tessadori等分析了與Nodal相關的Spaw基因和lft2的表達。注射prrx1a-MO1的胚胎顯示出這些左側基因的異常表達或缺失表達。
此外，注射prrx1a-MO1的胚胎在Kupffer囊泡中的纖毛數量顯著減少，並且該器官中prrx1a的表達低於在該階段可通過原位雜交檢測到的mRNA的水平。因此可以推斷prrx1a-MO1似乎更早地且非特異性地改變了Kupffer囊泡的結構，而不是破壞與Nodal相關信號傳導下遊的右旋心臟環化。
總的來說，Tessadori等表示沒有發現prrx1a在建立驅動斑馬魚心臟環化的右旋信號通路中的作用。儘管轉錄適應可以清楚地解釋某些基因的敲低和突變表型之間的差異，但在某些情況下（例如此處分析的心臟環化表型），MO1會產生不反映內源基因功能的非特異性效應。
值得注意的是，也有報導稱gRNA–Cas9會在斑馬魚胚胎中引起非特異性作用，且Tessadori等在研究中也發現prrx1a種系突變體缺乏由CRISPR–Cas9產生的prrx1a體細胞突變而出現的心臟環化表型【2】。Tessadori等在文章最後給出建議，即在解釋由基因編輯獲得的表型時應格外謹慎，尤其是在缺乏靶標基因功能先驗知識的情況下，應儘可能使用移碼和不經轉錄適應的較大轉錄本去除的種系等位基因對表型進行嚴格驗證。
對於Tessadori等的質疑，Ocaa等在同期Nature雜誌上進行了回復，主要針對兩個問題：1）在prrx1a-MO1胚胎中觀察到的中位心（mesocardia）表型是否是由於非特異性脫靶作用引起的；2）Prrx1a對於心臟偏側性是否是可有可無的。
首先，Ocaa等提出在原始數據中，L-R細胞向中軸的不對稱運動產生了不同的力，引起心臟後極向左側移動，觸發心臟的偏側性【2】。此外，還表明細胞運動由誘導上皮-間質轉化（epithelial–mesenchymal transition, EMT）的轉錄因子（Snail和/或Prrx）的L-R不對稱激活（在右側較高）介導，且這種細胞行為在斑馬魚，雞和小鼠中都是保守的。
隨後，Ocaa等為了進一步檢測心臟表型的特異性，採用另一種方法生成prrx1a-crispant胚胎（G0）並使用經過優化以防止產生脫靶效應的Cas9蛋白【12】。這些胚胎顯示出與先前描述的相同缺陷，即中位心（儘管外顯率較低）和心房大小減小，也包括其他缺陷如較小的頭部，這一表型也曾在prrx1a和prrx1b雙重突變體中觀察到。值得注意的是，Kupffer囊泡的纖毛和spaw的表達均正常，表明crispant胚胎沒有在MO1誘發的突變體胚胎中觀察到的Kupffer囊泡早期缺陷症狀。
接下來，Ocaa等使用產生crispant胚胎同樣的方法生成了一個prrx1a突變等位基因（prrx1ain69）。prrx1ain69轉錄本在外顯子1上沒有剪接位點，因此無法編碼功能性Prrx1a蛋白，因此，in69突變等同於prrx1a功能喪失突變。類似於prrx1a 無效突變體hu13685，hu13762和el803一樣，該突變體也未能顯示出中位心，正如Tessadori等所提示的Prrx1a對於心臟偏側性可能是非必要的，但這並不一定意味著Prrx1a不參與心臟偏側。
in69突變體的好處是，可以直接檢查靶向prrx1a的RNA guides的特異性，因為基因組中不存在相應的guide序列。當向prrx1ain69純合突變胚胎注入RNA guides時，沒有顯示出任何可檢測到的缺陷，而將這些guides注入野生型同胞胚胎中時則會導致中位心的產生。因此，儘管不能完全排除脫靶效應的存在，但這些證據都支持這次在G0 crispant胚胎中觀察到的中位心表型是靶向prrx1a基因的特定效應。
通過無義介導的mRNA降解或旁系同源物的激活引起的轉錄適應，這些機制被Tessadori等否定。但是值得注意的是，只要非同源基因具有相似的功能，也可以實現機制補償。Ocaa等在前外側板中胚層（anterior lateral plate mesoderm, ALPM）中發現的另外兩個EMT轉錄因子基因snail1b和twist1a的瞬時L–R不對稱表達模式，類似於prrx1a。
此外，snail1b或twist1a的G0 crispant胚胎也顯示出心臟偏側性表型，並且先前已經證明Twist轉錄因子可以與斑馬魚和癌細胞中的Prrx1協同作用[4]。因此，三個EMT轉錄因子在心臟偏側調節中相互配合，並且Snail1b和/或Twist1a可能補償Prrx1a的缺失，如果這種推斷成立的話，則說明缺乏Prrx1a對於斑馬魚心臟側偏缺陷是重要的。
最後，Ocaa等提出他們所闡述的脊椎動物心臟偏側化的機制，也類似的在小雞胚胎（使用siRNA）和小鼠胚胎（使用條件突變體）得到了證明【2】。這種機制與以前提出的L-R不對稱對心臟偏側性心臟後極貢獻的研究相一致【13】。總體而言，Ocaa等提出以上數據，包括先前對小鼠心臟發育的形態學，功能和計算研究均支持他們的結論，即脊椎動物心臟後極從中線的位移暗示了L–R EMT的差異。其他EMT轉錄因子是否能補償Prrx1a的缺失，以及心臟後極向左移位後如何出現右旋心臟環化，值得進一步研究。
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1, Raya A, Izpisúa Belmonte JC. Left-right asymmetry in the vertebrate embryo: from early information to higher-level integration.Nat Rev Genet. 2006; 7:283–293.
2, Ocaa, O. H. et al. A right-handed signalling pathway drives heart looping in vertebrates.Nature549, 86–90 (2017).
3, Zebrafish prrx1a mutants have normal hearts.
4, Ocaa, O. H. et al. Metastatic colonization requires the repression of the epithelial-mesenchymal transition inducer Prrx1.Cancer Cell22, 709–724 (2012).
5, Kok, F. O. et al. Reverse genetic screening reveals poor correlation between morpholino-induced and mutant phenotypes in zebrafish.Dev. Cell32, 97–108 (2015).
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