如何克服CRISPR脫靶效應?

2021-01-19 CellMax胎牛血清

除了改進GuideRNA的設計，Cas9突變體的出現將進一步降低CRISPR介導的脫靶突變。野生型Cas9具有兩個核酸酶結構域，每一個結構域切割一條DNA鏈。突變其中一個域使Cas9轉變成切口酶（nickase），該酶切割DNA形成單鏈斷裂。雖然切口酶突變體不改變sgRNA結合特異性並且仍能被轉運到脫靶位點，但單個切口的修復更可能是DSBs,而非NHEJ.然而，當設計兩個GuideRNAs,分別與染色體上的兩條鏈相結合，最終得到切割位點錯開的DSB，該DSB同樣可通過NHEJ或HR修復。兩個研究團隊：哈佛大學GeorgeChurch領導的團隊和MIT的張峰領導的團隊，都證明了「雙切口酶」法可有效地介導DNA通過NHEJ和HR進行修復（Ran,etal.,2013b;Mali,etal.,2013）。張峰團隊進一步驗證了雙切口酶法極大地降低了脫靶突變的頻率，將sgRNAs靶向3個不同基因，其脫靶突變頻率降低了50倍到1500倍。


雙切口酶的設計並不簡單。PAM距離最遠的sgRNA對（尾尾之間；Shen,etal.,2014）比PAM距離最近的sgRNA對（頭頭之間；Ran,etal.,2013b;Mali,etal.,2013）具有更高的插入缺失形成概率。另外，GuideRNAs間的距離是非常重要的。最有效的雙切口酶通常將距離控制在20個鹼基對以內。因此，當雙切口酶法有效地生成DSBs,伴隨著也產生了一些因脫靶裂解而引起的不良後果，但是設計的局限性限制了某些應用中需要的合適位點的潛在範圍。


再者，KeithJoung實驗室發表了兩篇描述新的潛在Cas9替代策略，同時可能提高CRISPR-Cas的特異性。其中一篇文章指出：在序列生成插入或缺失的概率方面，只有17個核苷酸的sgRNA與含20個核苷酸的sgRNA一樣起作用（Fu,etal.,2014）。一個靶向四個基因且截短了的sgRNA，所引起的脫靶突變概率降低了高達5000倍。另一篇文章（Tsai,etal.,2014）中，他們將無核酸酶活性（Cas9n）的Cas9突變體與FokI核酸酶結構域融合。FokI需要二聚體形式才能發揮切割功能，因此，與雙切口酶法相類似，一對Cas9n-FokI被證明可極大地降低脫靶效應。然而，截短sgRNAs（未表現出功能高效性）和融合Cas9-FokI（其設計受空間條件限制）等方法是否總是有效地發揮作用還是有待進一步研究的。

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