腦脊液（Cerebrospinal Fluid, CSF）是診斷中樞神經系統感染的重要標本，目前主要依賴常規生化、染色鏡檢、培養和血清學檢測判斷病原。然而這些方法有的靈敏度、特異度有限，易受抗菌藥物影響，有的周期較長，臨床仍有相當一部分感染的病原體（15～60% 腦膜炎和 40～70% 的腦炎）不能確定。
近年來，分子檢測技術突飛猛進，越來越多地應用到了病原體檢測領域。它是指利用標本中的核酸作為檢測對象，對病原體進行檢測的方法。具有特異性、靈敏度高、快速等特點。以下總結了當前已使用的腦脊液病原體分子檢測方法。
PCR 技術
PCR 是最常用的分子檢測技術。原理即擴增病原體特有的核酸片段，檢測以判斷病原體的存在與否。包括普通 PCR、RT-PCR、實時定量 PCR（real-time PCR）、16s rRNA PCR、商業化 PCR 系統等。許多臨床實驗室開發了實驗室自建 PCR 系統（laboratory-developed assay，LDA）；市面上也有可售的試劑盒以保證更標準統一的檢測。
1. 病毒性腦炎
病腦的 PCR 檢測事實上已替代培養成為診斷的金標準。HSV 腦炎的 PCR 靈敏度和特異度可達 96% 和 95%，CMV、VZV、JC 病毒以及 RNA 病毒如腸道病毒等的 PCR 檢測也顯示了較高的檢驗效能。其中 HSV 和 EV 的兩款試劑盒已被美國 FDA 通過用於病腦的診斷。實時定量 PCR 能檢測病毒的載量，在判斷是潛伏感染病毒還是致病病毒的活化時優於普通 PCR。
2. 細菌性腦膜炎
和培養相比，針對細菌的 PCR 檢測靈敏度達 87%～100%，特異度達 98%～100%，對某些細菌（如奈瑟球菌）尤為靈敏。可在數小時內出結果；且不受抗生素使用的影響。16S rRNA PCR 也被運用到細菌性腦膜炎的檢測中。16s rRNA 的基因存在於幾乎所有細菌中，用針對該基因片段的引物行核酸擴增，可以確定大多數細菌 DNA 的存在與否。根據該核酸片段種間序列的差異，通過測序技術或種屬特異的引物和探針，可以定位具體的細菌。
相比普通 PCR 檢測，16s rRNA PCR 同樣有靈敏、特異、快速的特點，其診斷細菌性腦膜炎的靈敏度達 92%，特異度達 94%；更為重要的是，由於其採用通用引物，無需進行針對性的病原體檢測，檢測病原體範圍更廣，減少遺漏細菌的可能。
缺點在於需要測序或其他後續檢測，成本相對高；任何汙染都可能引入雜菌而造成結果假陽性，因此標本無菌要求高；某些病原體由於種間序列的相似性，只能鑑定到屬；測序有拷貝數的要求，數量不足可能失敗；尚無標準化，各個實驗室間因處理方法不同而檢測效能不同。
3. 結核性腦膜炎
對於結腦的分子診斷，目前已有很多 LDA 和商業試劑盒試圖達到快速診斷。總體來看，結腦 PCR 檢測的靈敏度為 64%，特異度為 98%。有限的靈敏度、較高的成本和實驗室基礎和人員設置的要求都限制了結腦分子診斷的應用。
4. 自動化 PCR 檢測平臺
一些自動分子檢測平臺的出現使得腦脊液病原體的診斷有快速、簡便、自動化的趨勢，且相比傳統 PCR 檢測，無需很嚴格的實驗室配置，能保證更好的質量控制。
FilmArray 腦膜炎/腦炎系統是一款基於多重巢式 PCR 的 CSF 病原體檢測體系，由擴增機器和試劑條組成，試劑條控制反應體系，擴增儀控制反應條件。可對 200μLCSF 標本同時就 CNS 感染常見的 6 種細菌和 7 種病毒以及隱球菌進行排查。
FilmArray 腦膜炎/腦炎體系和檢測範圍
優點在於：
1. 靈敏、特異：目前較大樣本研究提示，其與標準 PCR 方法和測序相比，一致性較好；
2. 快速、便捷：手動操作 5 分鐘，其餘儀器全自動運行，能在 1 小時左右獲得結果。
3. 簡單易讀：操作和結果讀取均十分簡單，無須複雜培訓。適合實驗室條件一般的單位。
4. 不易汙染：體系封閉，且每份標本的測試試劑條均為一次性。
但目前價格昂貴。預估 1 次檢測的價格在 2000～3000RMB；且覆蓋的病原體儘管已經包括了常見的各種病原體，但結核分枝桿菌、金葡菌、蟲媒病毒等中樞感染常見病原體未被囊括；一臺機器 1 小時只能同時處理 1 份樣本，檢測通量不高。
Xpert MTB/RIF（Cepheid）是一款用於檢測痰標本結核分枝桿菌和耐藥性的自動化 PCR 平臺，也被嘗試用於 CSF 檢測。但和以往結腦分子檢測類似，已有的研究顯示了 67%～70% 的靈敏度和超過 90% 的特異度。靈敏度的不足和較高的成本限制了其應用。
Xpert MTB/RIF 儀器
環介導等溫擴增 Loop-mediated isothermal amplification
LAMP 是核酸等溫擴增技術的一種。該技術通過 2 對識別靶序列上 6 個特異區域的引物和一種具有鏈置換的 DNA 聚合酶，在恆溫條件下擴增靶序列，比傳統 PCR 具有更高的特異性和擴增效率且更迅速。有時增加一對環引物，使得擴增效率更高。已有用於細菌性腦膜炎檢測的報導。
其主要優勢在於：
1. 快速：比 PCR 反應時間更短（30～60 分鐘）；
2. 靈敏度高：小規模的研究顯示，對流感嗜血桿菌、腦膜炎奈瑟球菌、肺炎鏈球菌和結核分枝桿菌的檢測靈敏度和特異度均優於傳統 PCR；
3. 無需特殊儀器，操作簡單：相比傳統 PCR 技術，LAMP 實現了恆溫條件下的連續快速擴增，結果無需電泳或其他處理，用 DNA 結合染料（如 SYBR Green）處理後可肉眼觀察反應物顏色變化，因此可在幾乎任何實驗室中進行，成本低，適合資源相對缺乏地區和床旁檢測。
但有如下缺點：LAMP 採用的環引物增加了擴增效率，但容易產生非特異性配對而導致假陽性結果；引物要求高，要篩選出合適的引物需要耗費大量的工作；肉眼識別有主觀性，使用濁度計可改善結果判讀；只能針對性檢測單個病原體，無法進行廣譜檢測。目前用於 CSF 病原體檢測的研究尚不多，有待更多應用來支持。
新一代測序技術 Next Generation Sequencing
即相對於第一代 DNA 測序技術而言的新型測序手段，能更快地測定高通量的基因數據。通過提取腦脊液中核酸、建立 DNA 擴增文庫、測序，識別並排除人源性序列，可比對核酸來識別病原體的序列。該技術可行無靶向的病原體核酸廣泛測定，無需針對性的引物設計，理論上可以實現「全病原體」的檢測。目前主要用於疾病爆發時的病原體檢測、基因特點和分子流行病學調查。
有少量臨床利用 NGS 成功檢測患者 CSF 中病原體並治療的例子。但目前因為其對實驗室設備、人員、時間和結果解讀均有較高要求；高宿主核酸背景往往限制了檢測靈敏性；可用以結果分析的參考資料庫還不健全；不能很好區分定植、感染和汙染病原體，臨床的推廣還有很大的距離，可能有未來發展的潛力。
總結中樞神經系統感染的病原學診斷一直是個難題，傳統方法並不能較好滿足臨床的需要。PCR 的出現使得病原體快速診斷成為可能，隨著技術的發展，多種多樣的分子檢測技術和平臺不斷提高診斷的效能、範圍、便捷性和速度。但目前仍面臨成本、設施和人員配備的要求高、對某些病原體靈敏度不足等問題，尚不能完全替代傳統方法。有待更多的研究和對方法的改進和推廣。
參考文獻
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編輯：錢奕亦
審閱：艾靜文
專家審閱：金嘉琳