前言
G蛋白偶聯受體（G protein-coupled recptor, GPCR）是人類最大的膜蛋白家族，因為它們能夠調控多種生理過程，GPCR一直是藥物研發的關鍵靶點之一。據統計靶向GPCR藥物銷量佔全球市場的27%。然而，隨著對新型和改良藥物的不斷探索，開闢了靶向受體複合物的新策略。受體複合體是由核心受體蛋白和受體相關蛋白組成，對受體的整體結構、功能和定位有著深遠的影響。2020年12月11日，丹麥哥本哈根大學在 《Nature Reviews Drug Discovery》雜誌上發表了篇名為「Targeting receptor complexes: a new dimension in drug discovery」的文章，文中提出了靶向受體複合物中的關鍵蛋白為新藥研發提供了一個新的策略。在這裡，我們對G蛋白、G蛋白偶聯受體（GPCR）複合物、靶向GPCR複合物的策略以及靶向GPCR複合物的藥物進行介紹。雖然這些策略對於大多數受體複合物仍處於臨床前開發階段，但它們仍舊為這一新興研究領域奠定了基礎。
G蛋白的結構和種類
G蛋白（GTP結合蛋白）主要位於細胞膜漿面的外周蛋白，具有GTP酶的活性，與GTP結合後將其水解生成GDP。它一般是指與膜受體偶聯的異源三聚體，由
α、β和γ3個亞基組成，總分子量約100kD，如圖1所示。G蛋白有兩種構象，活化型構象和非活化型構象。α亞基與GTP結合後導致β和γ亞基脫落為活化型構象，α、β和γ3個亞基與GDP結合時為非活化型構象。
G蛋白的種類已多達40餘種，常見的有抑制型G蛋白（inhibitory G proteins）、激動型G蛋白（stimulatory G proteins）和磷脂酶型G蛋白，大多數存在於細胞膜上。除此之外，在細胞內還存在另一種G蛋白，該蛋白分子量小，20-30kD之間，不是以αβγ三聚體方式存在，而是單體分子，因此又被稱為小G蛋白，如ras表達產物就是一種小G蛋白。雖然該類蛋白具有鳥苷酸的結合位點，但該蛋白與跨膜信息的傳遞似乎沒有直接的關係。
G蛋白偶聯受體（GPCR）複合物
GPCR是真核生物中最大的一類膜蛋白家族，不僅種類眾多，其家族均具有相同的結構域：膜外N末端、7個α螺旋組成的跨膜結構域和膜內C末端。膜外N端負責與配體結合，並帶有糖基化修飾，如圖1所示。第3個包內環和肽鏈的羧基端上都含有鳥苷酸結合蛋白的結合位點。由於其胺基酸的序列在進化上缺少保守性，導致GPCR功能的多樣性。
根據GPCR序列以及配體的情況，研究者將其分為六種類型，分別是cAMP （環腺苷酸受體）、視紫紅質樣受體、真菌交配信息素受體、Frizzled /Smoothened 家族、代謝型穀氨酸受體以及分泌素受體。其中，視紫紅質樣受體含量最高，Frizzled /Smoothened 家族作為Wnt( Wingless / Integrated) 信號通路和其他信號通路的受體，在調節細胞增殖、神經突觸的形成等過程中起到重要的作用。
GPCR基因序列的改變、表達產物的變化和信號轉導的失調已被認為是惡性腫瘤的標誌。細胞膜上的GPCR的表達異常可刺激細胞不受調控地進行細胞增殖，通過細胞內信號的轉導，最終導致腫瘤細胞的形成、誘導血管的生成和轉移。這也使得該家族成員成為了最重要的藥物靶點。
圖1|GPCR複合體的結構和功能.GPCR複合物包括一個核心受體(GPCR)，以及位於細胞膜外、細胞膜中或者細胞膜內的受體相關蛋白。正構和變構調節劑直接靶向核心受體，但是受體相關蛋白及其與核心受體的蛋白-蛋白相互作用（PPI）可以被選擇性靶向，為藥物開發提供了新的方向（來源：Nat Rev Drug Discov）
GPCR複合物及其信號轉導
GPCR的多樣性決定GPCR涉及細胞內的多種信號通路，因此GPCR信號通路是細胞內重要的一類細胞通路。GPCR介導的信號通路包括：胚胎發育、免疫系統的調節、視嗅覺的控制、神經傳導等生理活動。GPCR能夠將激素、神經遞質等信號傳遞到細胞內，這在細胞功能調節中起到非常重要的作用。另一方面，GPCR和人類多種腫瘤的發生、發展和轉移有著密切的關係，它先通過改變細胞內第二信使的水平，然後通過與其相關的信號轉導通路對腫瘤進行調控。
目前認為GPCR主要通過兩種途徑對生理功能進行介導和調控：受體激活的G蛋白途徑和配體激活的β-arrestin途徑。前者，當GPCR受到外界的信號刺激後，G蛋白信號途徑被激活，包括MAPK/Erk 信號通路、cAMP 通路、磷脂醯肌醇信號通路等。持續強烈的GPCR信號將會影響細胞的生存以及發生不良反應，因此需要嚴格調控GPCR的信號。β-arrestin途徑阻斷G蛋白信號轉導，促進活化受體的內化，該途徑在脫敏、基因轉錄和細胞增殖等過程中起著重要的作用。
圖2|GPCR信號轉導的多樣性（來源：Nat Rev Cancer）
GPCR複合物與癌症
研究表明，GPCR家族的多種成員參與了各類癌症的發生。有些趨化因子受體（例如：CXCR2、CXCR4）在淋巴瘤、骨髓瘤中高表達，也在胰腺癌等實體瘤中高度表達，參與了腫瘤細胞的遷移以及血管的生成。有些蛋白酶激活受體（如PAR1），在MMP-1催化作用下激活下遊通道，促進癌細胞的惡化。有研究表明 GPCR在乳腺癌、肺癌、宮頸癌等癌症的發生、發展與侵襲轉移中起到重要作用。
圖3|GPCR誘導腫瘤血管的生成（來源：Nat Rev Cancer）
靶向GPCR複合物的策略
抗體
抗體具有高親和力、高選擇性、穩定性高以及低損失率等優點。最近批准的單克隆抗體erenumab就是一例，該抗體靶向降鈣素受體樣受體與受體活性修飾蛋白1的複合物，用於偏頭痛的預防治療。抗體也能靶向受體複合體的特定構象，使受體複合體的活性或非活性狀態得到穩定。近年來，隨著雜交瘤技術、抗體噬菌體展示技術以及高通量測序等多項技術的快速發展，抗體的臨床試驗數量顯著增加。噬菌體展示是一種廣泛應用於體外篩選全人源化抗體的技術，基於靶蛋白與噬菌體包膜蛋白的融合，進而將靶蛋白展示在噬菌體的表面，通過淘選技術獲得感興趣的抗體。
小分子
小分子的高通量篩選需要高質量、結構多樣的化合物庫。化合物庫容量約106，這些文庫通常包含之前藥物開發中用於離散結合口袋的化合物，然而這對於尋找受體複合物PPIs的小分子調節劑不一定有用，設計出良好且經過驗證的篩查檢測方法是至關重要的。GPCR篩選檢測通常包括細胞基礎的功能檢測，而不是簡單的結合檢測。雖然高通量篩選技術具有低命中率、假陽性率高以及低質量命中率等缺點。儘管如此，經過高通量測序和後續藥物化學方面的努力，最後獲得了靶向受體複合物的小分子，例如靶向AMPAR–TARPγ8複合物的化合物，它們仍在研究中。目前已報導的靶向GPCR的小分子是來自DNA編碼的化學庫，一般來說，DELs比HTS產生更多的小分子(109 vs 106)，DELs在製藥行業的廣泛應用為識別受體複合物調節劑帶來了希望，此外，由於DELs識別蛋白質結合物，這些分子和小分子一般可用於構建配體，以誘導受體複合體的靶蛋白降解。
多肽
在受體複合物調節需要置換兩種蛋白質的情況下，小分子可能不合適，然而，多肽不失為一個好的選擇。值得注意的是，多肽的不良藥代動力學仍舊是一個挑戰，需要在後續的優化過程中進行改進。受體複合物的多肽類抑制劑的設計首先需要了解PPI的關鍵結構信息（X射線晶體結構、核磁共振結構或者冷凍電鏡結構信息）。另外，許多肽顯示技術，如噬菌體顯示、核糖體顯示或mRNA顯示，可以用於識別和優化肽抑制劑。多肽的另一個主要挑戰就是細胞通透性較差，然而，大環化技術和連接細胞滲透性肽等策略已經解決了這個問題。該技術的臨床試驗應用仍處於觀望狀態。
圖4|靶向受體複合物的策略.a|通過噬菌體展示技術發現的單克隆抗體（mAb）可靶向受體複合物的細胞外PPIs. b|小分子的高通量篩選（HTS）和之後的藥物化學優化可成功靶向受體複合物的跨膜和細胞內PPIs. c| 基於結構信息或者肽展示技術可開發受體複合物PPI的基於肽的調節劑，例如SPOT, mRNA 展示或者噬菌體展示（來源：Nat Rev Drug Discov）
靶向GPCR複合物的藥物
CLCRL-RAMP1
調節降鈣素生成肽(CGRP)受體複合物治療偏頭痛是GPCR複合物藥物靶向的一個顯著例子。自從CGRP被發現以來，有關它在偏頭痛中起核心作用的證據越來越多。偏頭痛是一種複雜的神經系統疾病，可導致反覆發作、中度至重度的疼痛。CGRP受體複合物的核心成分是CALCRL，一種B類GPCR，參與激素穩態的調節。為了形成一個功能性受體，CALCRL必須與RAMP1結合，後者將CALCRL運輸到細胞表面，而RAMP1仍然與CALCRL結合，最終形成功能性CGRP受體複合物。RAMPs是單跨跨膜蛋白，RAMP1、RAMP2和RAMP3控制胰澱素和腎上腺髓質素受體的轉運、信號傳遞和藥理作用。
2018年5月，由Amgen和Novartis合作開發的偏頭痛單抗Erenumab獲得了FDA的批准，成為了首批用於治療偏頭疼的單克隆抗體。Erenumab是一種全人源IgG2單抗，能夠與CGRP受體結合，通過拮抗作用抑制偏頭痛激活相關CGRP受體的功能來預防偏頭痛。
目前，幾種CGRP受體複合物的小分子拮抗劑在臨床前和臨床研究中都顯示出了良好的效果。儘管它們的化學結構不同，但這些分子統稱為「gepants」。Gepants具有相同的作用機制：它們通過結合CALCRL-RAMP1的接口來阻止CGRP的結合。一些gepant，包括olcegepant和 telcagepant，減輕了偏頭痛症狀而沒有出現心血管副作用，但一些gepant臨床試驗由於出現肝毒性而終止。2019年12月， FDA批准Ubrelvy（ubrogepant）用於成人偏頭痛（有或無先兆）急性治療。2020年2月，rimegepant被FDA批准用於急性偏頭疼治療，如圖5a所示。
GBRs和KCTD蛋白
GBR是異質二聚體C類GPCRS，其結構包括一個GB1a亞基或一個GB1b亞基和一個GB2亞單位。KCTD蛋白(KCTD8、KCTD12、 KCTD12B和KCTD16)是結合到GB 2亞基c端和G蛋白的Gβ亞基的胞漿蛋白。大腦中主要的抑制性神經遞質GABA通過激活突觸前和突觸後G蛋白偶聯GABAB受體(GBRs)進而調節突觸傳遞。GBRs在整個中樞神經系統中都有表達，其功能發生障礙將導致神經和神經精神疾病，包括癲癇、疼痛、痙攣、自閉症譜系障礙、抑鬱、精神分裂症、焦慮和成癮。市場上只有兩種針對GBRs的藥物：巴氯芬和γ-羥基丁酸，主要用於治療痙攣、酒精使用障礙和與嗜睡症有關的猝倒。然而，鎮靜和肌肉鬆弛等副作用影響了這些藥物的廣泛使用，如圖5b所示。
圖5| 靶向GPCR複合物（來源：Nat Rev Drug Discov）
總結
受體複合物在藥物發現中提供挑戰的同時也帶來了新的機遇。我們正處於研究靶向受體複合物藥物的初級階段，以生產更有效、更有選擇性和更安全的藥物。靶向受體複合物需要考慮合適的篩選策略，沿著這條思路，揭開天然受體內的全部蛋白質的面紗顯得尤為重要。只有這樣，我們才能開發出準確定位生物靶標的分析方法，為新藥研發提供更廣泛的候選。
參考文獻
Rosenbaum MI, Clemmensen LS, Bredt DS et al. Targeting receptor complexes: a new dimension in drug discovery.[J] .Nat Rev Drug Discov, 2020, 19: 884-901.
Dorsam RT, Gutkind J S ,G-protein-coupled receptors and cancer.[J] .Nat Rev Cancer, 2007, 7: 79-94.