新型StrataQuest定量分析方法:聊聊宿主-病原體之間的那些事兒

2021-01-10 生物谷

探究宿主-病原體相互作用的特點是研究微生物與免疫學方向學科的重要方法。宿主細胞吞噬病原體後其表徵將會改變。利用實時PCR儀或者ELISA的技術，測量與基因編碼蛋白相關的行為是消除病原體還是免疫逃逸。多數研究都利用主要宿主細胞或者細胞系在體外實現。該方法得到的數據能夠說明RNA的表達或細胞培養中回收的蛋白質的量。在實驗條件下，所有的宿主細胞擁有相同數量病原體具有合理性。然而，利用吞噬細胞的病原體吸收是不同步的。所以，包含了不同數量病原體的宿主細胞導致不同致病菌誘導的蛋白質生物合成。因此，我們構建了一項技術應用免疫螢光高通量分析方法用來檢測與宿主細胞相關的病原體的數量。結合多色分子染色，使分析宿主細胞種群的感染情況和寄生負荷的結果（相關宿主細胞的表型）變成可能。

寄生蟲與宿主細胞的聯繫是微生物學和免疫學其中重要的一部分。隨著單克隆抗體和螢光標記試劑應用的產生，關於宿主細胞在進程中的變異研究越來越多。

事實上，科研中已經存在利用多通道流式細胞分析術和螢光顯微技術方法來檢測寄生蟲與宿主細胞關係。以上兩種方法都具有優缺點。流式細胞分析術（FACS）能夠檢測擁有寄生蟲的宿主細胞的表型，但是不能精確到單細胞中寄生蟲的數量。而且，流式細胞分析需要單細胞製備所以不能做到細胞原位的定位。雖然螢光顯微技術的準確性更高，擁有寄生蟲的宿主細胞可以說明原位表面marker的表達情況。但是，做到宿主細胞寄生負荷marker強度的高度客觀仍然存在困難。因此，一種能夠將單細胞定量和宿主細胞表型分析相結合的技術是十分必要的。

實驗的分析部分，我們利用了奧地利TissueGnostics公司的TissueQuest和StrataQuest軟體，此軟體能夠同時滿足單細胞定量分析和宿主細胞表型分析。以Dot-Finder專利運算法為核心的新型高通量多色顯微成像技術，分析感染了L.major的原位及體外巨噬細胞。該方法做到了對擁有病原體的成核細胞的全面分析。與流式細胞術（FACS）相比，螢光標記marker的強度能夠在原位單細胞級別定量且不需要製備細胞懸浮液。另外，TissueQuest軟體能夠實現從實驗數據精確反向回溯到影像中的細胞。反向回溯的特徵可以用來檢測原位細胞亞群，設門細胞的定位信息。同樣，此項功能可以作為最終的結果構象。

本實驗中應用三種marker：DAPI為核染色marker，AF546（CD11b）和Cy5(F4/80)為另兩種。

通過調節如下簡單參數完成軟體分析：

a.核的尺寸

b.面積

c.灰度值

應用反向回溯特點實時觀察創建的陽性細胞散點圖。根據細胞尺寸和染色強度確定cut-off值。檢測DAPI的陽性值和細胞中活性L.major，利用ring mask功能創建DAPI通道。

淋巴腺體部分的胞內病原體檢測

上圖中為TissueQuest軟體的細胞核檢測和ring mask計算功能。灰階圖影像利用StrataQuest軟體進行分析。單通道灰階影像利用TissueQuest軟體進行分析。
（A）通過參數調節進行核檢測（B）創建ring mask (C)ring mask中黃色高亮部分為自動篩選ROI中病原體。

TissueFAXSi-plus設備完成了影像的掃描部分

利用此設備做到單通道影像獲取，利用四通道進行螢光檢測（DAPI,FITC,Rhodamin,Cy5）。每個影像包含將近50-200個細胞，並且TissueFAXS能做到自動拼接。利用TissueQuest軟體的參數進行核檢測。每個螢光通道的影像和多個FOV都能夠被自動獲取，收集和後期的組合。

TissueQuest檢測各種ring mask中的L.major病原體

根據活性病原體的微弱DAPI信號和複雜的背景信息，新型的運算法需要從中識別病原體。每種獨立的運算法不可能同時滿足所有的實驗需要。Parasite finder預設程序可根據用戶需要選擇方法最高程度的區別背景與待分析部分。（A）ring mask圈出胞質部分，代表缺少病原體培養的條件下的巨噬細胞。（B）藍色部分為感染的巨噬細胞的ring mask,黃色箭頭標出DAPI的陽性信號。（C）舉例說明的運算法用來檢測微弱信號區別沒有被感染的巨噬細胞的ring mask中的偽信號。（黃色部分）（D）創建偽陽性信號。多於30個病原體的巨噬細胞被藍色標出。（E）檢測微弱信號區分沒有被感染的巨噬細胞的ring mask中的非偽信號。（F）所有被感染的巨噬細胞（黃色部分和黃色箭頭）均被識別出。

TissueQuest定量分析感染的巨噬細胞病原體密度和感染比例

（A）軟體自動計算感染與未感染的巨噬細胞。（B）每個巨噬細胞胞內寄生蟲的平均數量的定量分析。在分析了237個與8639個細胞後，得出隨即選擇的樣本足以證明總感染比例的正確性。（C）胞內寄生蟲與巨噬細胞的關係。胞內病原體的數量和Y軸相應的病原體對應的巨噬細胞擁有病原體的數量區間。
此圖闡明巨噬細胞中的活病原體的高度混雜性。推測原因為多樣化的吞噬作用和病原體繁殖的加強。巨噬細胞的表型決定胞內病原體擴張存在可能性。

利用感染與未感染的原位巨噬細胞定量分析骨髓細胞marker的表達

TissueQuest軟體根據胞內病原體，估算每個成核原位宿主細胞。通過擁有不同數量病原體的巨噬細胞，比較不同marker的表達。

擁有不同寄生蟲數量的巨噬細胞的表型分析。

(A)直方圖表示X軸巨噬細胞擁有病原體與Y軸病原體的數量。TissueQuest軟體得到細胞核，ring mask，ring mask中的病原體，ring mask中的CD11b或者F4/80的強度表達（B）擁有不同數量病原體的巨噬細胞的平均強度分析。

體外原位成活與失活胞內病原體的診斷

此圖為體外活細胞和死細胞的定量分析。因為失活病原體不能夠吸收DAPI，所以軟體能夠做出宿主細胞中病原體的區別。對樣本進行EB-AO平行染色。StrataQuest識別細胞的胞質（綠色部分），細胞與細胞接觸部分（橘色）。

（A）AO灰階圖用於薄膜的檢測（綠色部分），細胞邊緣的確定（橘色部分）。（B）對粘連細胞進行詳細分析。（C）反向回溯確定巨噬細胞擁有多於2個失活寄生蟲。（E）擁有失活寄生蟲的巨噬細胞的頻率分析。（F）擁有不同數量失活寄生蟲的吞噬細胞的頻率分析。

冰凍切片利用DAPI染色然後TissueQuest進行分析。DAPI的信號指出病原體的DNA並未退化。活檢，活檢，乾燥前的病原體仍然具有活性。StrataQuest軟體創建胞核（橘色）和核膜（綠色）。因此，DAPI陽性病原能夠在宿主細胞的胞漿部分進行識別。

此圖為寄生負載的評估。（A）被感染的淋巴腺。灰階圖為DAPI+宿主細胞核和寄生蟲DNA。（B）胞核，胞漿和寄生蟲的重疊影像（C）（D）反向回溯擁有3和5-10寄生蟲的細胞（E）感染細胞的寄生負載。

此實驗中，TissueQuest和StrataQuest軟體能夠檢測如下特點：

1)寄生負擔

2)感染細胞的表型

3)定位

4)細胞-細胞聯繫

後續研究中會著重在宿主-寄生蟲的聯繫的分子反應機理，在微生物方向疾病治癒做出提高。（生物谷Bioon.com）

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