The Scientist:胞外體最新研究進展

這些小膜囊泡的功能遠不只是清除細胞垃圾---它們也攜帶信號到身體上距離較遠的部分，從而能夠影響細胞生命的多個方面

圖1來自Keith Kasnot

【towersimper註：本文為譯文，有部分改動，僅用作研究之用，不得用作商業開發，轉載請標明翻譯者towersimper，原文來自Clotilde Théry, The Scientist, "Exosome Explosion", July 1, 2011】

分泌的稱作胞外體(exosome)的囊泡(vesicle)第一次發現是在將近30年前。但是，當初人們僅僅認為它是垃圾桶，它的工作是丟棄不想要的細胞組分，因此在第一次發現後接下來的10年，這些小囊泡一直很少有人研究。不過，過去幾年，證據開始積累，表明這些細胞中的垃圾桶也作為信使，竟然傳遞信息到相隔較遠的組織。胞外體含有細胞特異性的蛋白質、脂質和遺傳物質，這些裝載物運送到其他的細胞，從而改變它們的功能和生理。

不過最近幾年人們對胞外體的研究興趣越來越濃。快速掃視一下發表的論文就能證明這種趨勢：2003年僅有大約20篇PubMed引用的含有「胞外體」單詞的論文得以發表，2007年剛好超過60篇，從那以後將近有500篇關於胞外體的研究文章得以發表。接下來將談談胞外體的研究歷史、難題、挑戰和潛在的應用。

圖2信息圖：胞外體基礎

胞外體基礎

胞外體是由大多數類型細胞分泌的膜小囊泡。內囊泡(internal vesicle)通過稱作多囊泡胞內體 (multivesicular endosome, MVE)的細胞區室通過向內出芽的方式形成。當MVE與細胞膜融合時，這些內囊泡就作為胞外體被釋放到胞外，這些胞外體能夠運行到距離較遠的組織從而影響細胞行為和生理上很多方面。

如圖2所示，胞外體形成的第一步是，MVE向內出芽形成小的內囊泡，這些內囊泡含有蛋白質、mRNA和miRNA①。當MVE與細胞膜融合時，這些內囊泡作為胞外體被釋放到胞外②。或者，MVE能夠與溶酶體融合，而溶酶體能夠降解MVE中包含的物質③。一旦胞外體到達它們的目的地，而目的地通常是由胞外體表面上的特異性配體結合的方式決定的，這樣胞外體能夠以兩種途徑進入靶細胞：通過靶細胞胞吞作用攝入到細胞內④，或者通過融合到靶細胞膜，從而直接釋放它包含的物質到細胞質中④。細胞也分泌其他膜來源的囊泡，比如核外顆粒體、脫落的囊泡或微泡，它們也是直接從細胞膜出芽產生的⑥。已知這些囊泡也攜帶活性的蛋白質和RNA以及一些以前從未在胞外體中描述過的化合物，但是它們對距離較遠的組織的影響人們知之甚少。

胞外體：歷史

胞外體尺寸小(直徑大約150納米或者更小)，能被大多數類型細胞分泌出來。它們形成於細胞內稱作多囊泡胞內體(multivesicular endosome, MVE)的區室中，其中這種多囊泡內體是將少量細胞質及其包含的物質帶到膜包圍的小囊泡裡。MVE最初被認為只是有助於運輸胞外細分子到溶酶體中進行降解。但是，大約25年前，研究人員描述了一個相反的過程---發育中的紅細胞MVE與細胞膜融合，釋放出它們所包含的物質，包括眾多小囊泡(後來被稱作胞外體)，到細胞外面。

為了證明這一過程，研究人員把未成熟的稱作網狀細胞(reticulocyte)的紅細胞，在放射性的轉鐵蛋白或者結合到轉鐵蛋白的細胞表面受體的放射性抗體存在下，進行培養。每隔15分鐘，他們固定一部分細胞，用電子顯微鏡對它們拍攝照片，這樣當轉鐵蛋白或它的細胞表面受體通過細胞內吞途徑從細胞表面進入細胞，再經過不同的細胞區室進入MVE時，就可以追蹤其行跡。仍然結合到受體上的轉鐵蛋白被扣押在小囊泡中，而這些小囊泡則是在更大的MVE內部形成。令人吃驚的是，顯微圖片表明一些MVE與細胞膜融合，將這些攜帶轉鐵蛋白及其受體的小囊泡釋放到細胞外部。

然而接下來的15年，胞外體被人們遺忘了---直到1996年，Raposo發現免疫細胞如B淋巴細胞也分泌胞外體，和這些囊泡攜帶膜包圍的對適應性免疫反應而言必不可少的分子[1]。在此兩年後，進一步的研究還證實另一種分泌胞外體的細胞類型：樹突細胞(dendritic cell)，它的胞外體攜帶功能性的免疫試劑，而這些試劑能夠促進小鼠產生抗腫瘤免疫反應[2]。這些結果為提出下面假說提供基礎：胞外體可能在細胞間通信中發揮著積極作用，同時也促使人們探索它們的臨床應用。法國古斯塔夫洛塞研究所(Gustave Roussy Institute)在當前領導的第二期臨床試驗中，正在測試將胞外體作為一種新形式的輔助療法，來治療不能手術的肺癌[3]。

在過去幾年，大規模蛋白分析技術的發展允許研究人員詳述胞外體運輸的貨物類型[4]。不同類型細胞分泌的胞外體攜帶特異性的一組蛋白，而且這些蛋白不同於凋亡細胞釋放的膜囊泡中含有的蛋白，從而表明胞外體是由活細胞積極地分泌的。儘管一些類型細胞在沒有任何明顯的刺激下就釋放這些囊泡，但是分泌胞外體的信號仍不清晰。其他類型的細胞，如B和T淋巴細胞，僅當通過結合細胞表面受體而給與刺激的情況下，才會分泌數目可測量的胞外體。

最近對體外純化的胞外體的研究表明囊泡能被其他細胞捕獲，因而傳遞胞外體內部或表面包含的一些信息。比如，抗原呈遞細胞通過胞外體分享捕獲的和消化的病原物，增加針對侵入者的免疫反應的範圍和強度。其他胞外體結合的分子能夠誘導它們遇到的靶細胞失活或者甚至是死亡。比如，一些胞外體在它們的表面展示Fas配體，一旦該配體結合到Fas受體(也被稱作死亡受體)就啟動細胞凋亡。

2007年，瑞典人Jan L?tvall領導的一個研究小組發現了胞外體內部含有mRNA和microRNA[5]。而且，體外實驗表明這些mRNA能在靶細胞中翻譯表達為蛋白質，從而第一次提供證據證明胞外體轉移遺傳物質。這一非凡的發現不僅指示一種新形式的細胞間通信，而且還表明就意義上而言，胞外體可能行為表現類似於病毒，因為它們攜帶遺傳信息，而且這些遺傳信息能在它們「感染」的細胞中翻譯為蛋白。該發現以及伴隨的對microRNA的研究已促進人們最近對胞外體研究的熱情，和相關發表文章的激增。

功能迷霧

相對於單分子調節物，如脂質、激素或細胞因子而言，考慮到胞外體複雜的結構，它們能夠給它們遇到的細胞帶來更加強有力的影響。舉例來說，胞外體在它們的表面攜帶特異性模式的配體和受體，從而可能允許它們瞄準攜帶合適的反配體(counterligand)的特異性類型細胞。再者，它們攜帶的大量蛋白質、脂質，甚至核酸組分，能夠影響靶細胞內部的多種信號傳導途徑，而單個分子通過結合靶細胞表面上單個受體的方式僅僅啟動單個途徑。

根據分泌胞外體細胞的類型和生理狀態，胞外體與它的受體細胞相互作用誘導的變化能夠差異很大，要麼能夠有助於防禦疾病，要麼在一些情況下惡化疾病[3]。比如，成熟的樹突細胞分泌的胞外體攜帶抗原，或者嵌入在它們的脂雙層中的MHC-肽鏈複合體，能夠誘導抗原特異性的免疫反應。另一方面，在免疫抑制試劑存在的培養物中，小鼠樹突細胞分泌的胞外體能夠促進免疫耐受性。類似地，非病原性的分枝桿菌感染的巨噬細胞釋放的胞外體攜帶細菌抗原，然後被其他的抗原呈遞細胞攝取從而促進免疫反應。相反地，病原性的分枝桿菌菌株感染的巨噬細胞釋放的胞外體抑制巨噬細胞激活和細胞因子釋放，因而抑制將由分枝桿菌抗原誘導的免疫反應。這種致病菌在胞外體通信層次上似乎已進化以便有利地控制宿主的免疫系統，儘管其中的細節仍然有待闡明。

癌細胞分泌的胞外體攜帶來自腫瘤的抗原，能夠被樹突細胞捕獲並被用來呈遞腫瘤抗原，從而激活針對這種癌症的免疫細胞。然而，這些胞外體也含有各種各樣的免疫抑制分子，而且這些分子要麼能夠使得T淋巴細胞或自然殺傷細胞(natural killer cell)失活，要麼促進抑制免疫反應的調節性T淋巴細胞或骨髓細胞(myeloid cell)的分化。人們仍不清楚這些相互對立的影響的淨效應對患有癌症的個人而言是有益性的還是有害的。幾個研究小組的研究結果已經表明腫瘤分泌的胞外體通過抑制抗腫瘤免疫反應，或者通過在腫瘤轉移過程中促進血管生成或腫瘤遷移到身體其他部分的方式，從而促進腫瘤的生長[6]。然而，即便是發現來自腫瘤的胞外體在癌症病人體中進行循環，這可能僅僅是腫瘤擴張的結果，可能並不意味著這種膜囊泡積極地參與腫瘤演化(tumor progression)。在癌症病人身上，腫瘤分泌的胞外體促進腫瘤生長的證據仍然缺乏。

其他組織或細胞也分泌攜帶免疫抑制分子的胞外體。比如，胎盤來源的囊泡攜帶針對自然殺傷淋巴細胞和其他免疫系統組分的抑制性配體，從而可能阻止對胎兒的免疫攻擊。類似地，支氣管肺泡液體中存在的胞外體和其他囊泡能夠將一種過敏原的抗性轉移給其他動物。當從已經耐受某種過敏原的小鼠中純化的胞外體注射進天然小鼠，這種對該過敏原敏感的小鼠也對該過敏原引發的過敏性反應產生抗性。另一方面，支氣管肺泡液體中的胞外體也能夠增強促炎症反應，因為當從哮喘病人中純化的胞外體同支氣管上皮細胞一起培養時，支氣管上皮細胞作出反應，分泌出促炎症的細胞因子。人們最近已發現，真核生物的寄生物或致病菌分泌胞外體[7]，其中這些胞外體能夠有助於宿主產生對入侵者的耐受性(通過抑制免疫反應)，或者，相反地，促進宿主在入侵者存在時產生病理性炎症反應。

除了免疫系統之外，胞外體可能影響其他的生理功能。神經細胞、上皮細胞、肌細胞和幹細胞分泌的胞外體可能存在的功能包括促進組織修復、神經系統內通信以及諸如朊病毒蛋白和澱粉樣沉積之類的病理性蛋白質的形成和轉移。比如，神經元分泌攜帶神經傳遞質(neurotransmitter)受體的胞外體，因而能夠參與胞外空間的神經傳遞質的清除從而阻止信號傳導，而且/或者傳遞這些受體到其他細胞，從而使得它們對神經傳遞質作出反應。總之，不容置疑的是，在未來幾年，其他的系統和功能肯定會出現。

胞外體研究的挑戰

儘管有關胞外體誘導靶細胞發生變化的數據不斷增加，但是所有這些研究都是在體外濃縮的囊泡中進行的。在大多數情況下，細胞培養物放置在使細胞死亡最小化的條件下以便確保待分析的囊泡不受破裂的、臨死的細胞濺出的隨機性細胞碎片的汙染。然而，考慮到這種技術上的挑戰，對來自整個器官的胞外體進行的可靠性純化仍然是難以實現的。機械或化學上的組織破壞將不可避免地弄碎一些細胞，使得將自然存在於胞外空間的胞外體很難與人為造成的破裂細胞中釋放的囊泡分離開。

再者，對研究人員而言，將胞外體與其他的分泌出的囊泡，如核外顆粒體(ectosome)、脫落的囊泡(shed vesicle)和微泡(microvesicle)---直接從細胞膜上出芽而出---區分開來也是一個長期存在的挑戰。類似於胞外體，膜微泡含有各種各樣的活性分子，如細胞因子，生長因子受體和RNA，但是它們也含有在胞外體中沒有被描述過的化合物，如金屬蛋白酶---該酶降解胞外基質組分而且參與腫瘤轉移。胞外體能夠通過在不同轉速的超離心方法與不同大小的囊泡分離開來，這是因為較大的囊泡要比較小的囊泡在較低的轉速下沉澱，但是不同細胞內來源(比如胞外體和某些細胞膜來源的囊泡)的大小類似的囊泡不能通過這種方法分離，這樣就很難確定胞外體特有的影響。

用來純化的胞外體進行的大多數胞外體研究這一事實也使得人們很難了解使用的大量膜囊泡在體外和模式動物中觀察描述的影響是否具有生理學上的相關性。確實，一些胞外體研究人員懷疑囊泡在體內是否確實有生理學上的功能。

解答這個問題則需要一些方法來抑制或增強胞外體分泌，但同時又不影響其他膜囊泡的分泌，或者蛋白質或脂質調節物的一般性分泌。幾個研究小組當前正在開發這樣的方法，特別是通過解析參與胞外體形成及其與細胞膜融合的分子機制。然而，一點也不奇怪的就是，人們在這些機制上還未達成共識。確實，基於不同的細胞類型，在胞外體的生物形成和分泌過程中，人們已描述過許多不同的分子。研究人員已經提出其他的方法來闡明胞外體在體內的生理功能，比如產生帶有功能性蛋白的修飾性表達的胞外體，或者將酶插入到胞外體中從而通過測量酶活性的方法來確認靶細胞。在遺傳修飾過的小鼠中採用這些方法將會是戰勝這些挑戰的下一步。

研究分泌的膜囊泡及其它們作為細胞間信使的角色是一個非常有趣的領域，伴隨著新的觀點，假設，以及由此產生的疑問遠比給出的答案來的快得多。2011年在巴黎居裡研究所召開的國際胞外體研討會(International Workshop on Exosomes)讓大多數長期的胞外體和囊泡狂熱愛好者遇見很多新來者，並與他們交換思想，以及指出當前在技術、定義和特徵上的問題。這次討論會議最終還達成以下共識，即繼續保持本次非常有益的研討會的這種勢頭，設置未來年會和虛擬空間來鼓舞進一步討論，並成立一個科學協會致力於胞外體和分泌的膜囊泡的研究。基於這種目的，下次研討會安排於2012年4月在瑞典哥特堡市召開；一個臉譜(Facebook)網頁(稱作胞外體、微泡和其他分泌的膜囊泡)和一個用於比較胞外體中蛋白質和RNA組分的網站如今成立並在運行，其餘的安排也有望很快確定下來。

膜包圍的生物標記？

確定胞外體中的RNA以及用於核酸分析的高通量技術的開發已經激起最近在這些膜囊泡中存在的遺傳物質序列方面的研究論文的急增。並不是一個細胞中存在的所有mRNA最終都出現在胞外體中，這就表明只有特異性得到mRNA序列包裝在這種釋放出來的囊泡內部[5]。然而，是否存在一組mRNA一貫地靶向到特定類型細胞的胞外體，就像胞外體蛋白質那樣，仍然有待人們來確定。儘管也不清楚是否存在microRNA(miRNA)特異性地靶向到這些分泌的囊泡中，但是人們已經在很多種類的胞外體製備中觀察到miRNA分子。

儘管關於攜帶mRNA和miRNA的囊泡的性質充滿著不確定性，但是一些生物技術和製藥公司已經開始啟動一些開發項目，利用分泌的囊泡中包含物作為生物標記來診斷各種種類的疾病。包裹在膜囊泡內部的RNA分子受到保護而不會被RNA酶降解，因而允許把它們從諸如血漿、尿液、牛奶、精液或唾液之類的液體中進行有效回收。不同實驗室中正在進行的研究工作旨在將從正常細胞系和癌細胞系分離出的囊泡中的RNA和蛋白質序列與在患有癌症和其他疾病的病人的生物液體裡發現的胞外體中的那些序列進行比較。提出把胞外體及其包含物作為新的生物標記仍嫌太早，但是考慮到當前進行的努力，接下來幾年人們肯定會確定這些標記是否存在以及是否有用。然而，值得關注的是，循環miRNA (circulating miRNA)也能夠被蛋白複合體保護而免於受到RNA酶降解，因而相對於膜包圍的miRNA，蛋白保護的miRNA作為標記的相對重要性也將不得不接受評估[8]。

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參考文獻:

1.G. Raposo et al., 「B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles,」 J Exp Med, 183:1161-72, 1996.

2.L. Zitvogel et al., 「Eradication of established murine tumors using a novel cell-free vaccine: dendritic cell-derived exosomes,」 Nat Med,4:594-600, 1998.

3.N. Chaput, C. Théry, 「Exosomes: immune properties and potential clinical implementations,」Semin Immunopathol, (in press) 2011.

4.S. Mathivanan, R.J. Simpson, 「ExoCarta: A compendium of exosomal proteins and RNA,」Proteomics, 9:4997-5000, 2009.

5.H. Valadi et al., 「Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells,」 Nat Cell Biol, 9:654-59, 2007.

6.M. Iero et al., 「Tumour-released exosomes and their implications in cancer immunity,」 Cell Death Differ, 15:80-88, 2008.

7.J.M. Silverman et al., 「Leishmania exosomes modulate innate and adaptive immune responses through effects on monocytes and dendritic cells,」 J Immunol, 185:5011-22, 2010.

8.J.D. Arroyo et al., 「Argonaute2 complexes carry a population of circulating microRNAs independent of vesicles in human plasma,」 PNAS, 108:5003-08, 2011.