《Small Methods》復旦俞麟：三模態生物成像可視化演變的水凝膠

【前沿背景】

新世紀正在見證從生物穩定材料到可生物降解材料的範式轉變。儘管生物材料的可降解性為其臨床應用帶來了許多機會，但它也面臨著巨大的挑戰。可生物降解材料的體內進化在實現預期功能方面起著至關重要的作用。

【科研摘要】

由於缺乏足夠的實時觀察方法，關於體內系統生物降解的報導非常有限。最近，復旦大學俞麟教授團隊開發了一種三峰生物成像技術，可以實時監測體內合成聚合物的生物降解。演示的材料是一種成功的臨床前共聚物PLGA-PEG-PLGA熱敏水凝膠，在加熱時會經歷自發的溶膠-凝膠轉變。設計併合成了大分子螢光探針和磁共振成像（MRI）的造影劑。在將含有兩種探針的水凝膠皮下注射到小鼠體內後，通過超聲，螢光和MRI的協同應用，可以縱向和無創地追蹤材料的降解行為。將無創成像與傳統解剖學觀察相結合，首次提出了這種水凝膠的三階段降解機理。另外，體內溶解的聚合物和降解產物主要通過肝臟，膽囊和脾臟清除。這項工作對於促進這類有前途的水凝膠的未來臨床應用具有重要價值。同時，該技術平臺為研究生物材料的體內命運提供了有益的啟示和方法。

【圖文解析】

在這項研究中，選擇具有合理溶膠-凝膠轉變溫度以適合體內生物醫學應用的熱敏PLGA-PEG-PLGA水凝膠作為模型。羅丹明B（RB）被共價修飾到PLGA-PEG-PLGA聚合物的末端以用作螢光探針，並且作者製備的磁性納米顆粒（MNP）CoFe2O4被截留在凝膠基質中以增強MRI信號，如圖1a所示。評估了引入探針對聚合物水凝膠熱誘導的溶膠-凝膠轉變的影響。皮下注射水凝膠到ICR小鼠後，通過同步應用超聲，螢光和MRI無創地跟蹤體內降解行為，如圖1b所示。比較並討論了這三種成像技術的優缺點。最後，結合傳統的解剖學觀察和組織學檢查，首次展示了熱敏PLGA-PEG-PLGA水凝膠在體內的進化過程。

圖1. a）MNPs@RBGel設計和製造的示意圖。b）通過螢光，超聲和MRI對小鼠熱敏PLGA-PEG-PLGA水凝膠的體內降解進行無創監測的示意圖。

2.1 PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物和帶有RB標籤的PLGA-PEG-PLGA的合成和表徵

PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物是通過乙交酯（GA）和d，1-丙交酯（LA）的本體開環聚合反應合成的，其中辛酸亞錫（Sn（Oct）2）為催化劑，PEG1500為大分子引發劑。詳細見原文。

2.2 CoFe2O4納米粒子的合成與表徵

CoFe2O4納米粒子是通過在油胺和油酸存在下，通過乙醯丙酮鈷（II）（Co（acac）2），乙醯丙酮鐵（III）（Fe（acac）3）和1,2-十六烷二醇的高溫溶液相反應製備的。通過電感耦合等離子體發射光譜儀測定的Fe和Co的比例分別為68.5％和31.5％。透射電子顯微鏡（TEM）的觀察表明，納米粒子的平均尺寸約為≈7 nm，動態光散射（DLS）結果證實了納米粒子的單分散分布（圖2a）。DLS分析中納米顆粒的平均尺寸（12 nm）。

圖2. a）CoFe2O4納米顆粒，b）PLGA-PEG-PLGA水溶液和c）包含CoFe2O4納米顆粒和RB標記的PLGA-PEG-PLGA（CoFe2O4: 3 µg mL-1，RB:1 µg mL-1）)的PLGA-PEG-PLGA水溶液的DLS和TEM結果。

2.4 PLGA-PEG-PLGA和MNPs@RBGel系統水溶液的宏觀Sol-Gel轉變

具有不同聚合物濃度的PLGA-PEG-PLGA水溶液的溶膠-凝膠轉變溫度（Tgels）通過樣品瓶轉化方法確定。臨界膠凝濃度為≈4wt％，高於該濃度，聚合物/水體系會隨著溫度的升高而經歷三種獨特的狀態：溶膠，凝膠和溶膠（懸浮液）。25 wt％的聚合物溶液的Tgel為35°C，表明該系統能夠在生理條件下形成原位水凝膠，適用於體內研究。進一步進行動態流變學測量，以觀察具有或不具有探針的聚合物/水系統的儲能模量（G&39;&39;小於G&39;，表明該系統處於溶膠狀態。當溫度高於30°C時，G&39;&39;的增加速率大於G&39;的增加速率，這表明發生了溶膠-凝膠轉變。

2.7 體內水凝膠降解的螢光分析

作為高度敏感和快速響應的成像方式，螢光成像已被廣泛用於監測材料以及細胞的體內命運。眾所周知，動物的放置具有重要意義。影響獲得的螢光數據。在這項研究中，首先進行了X射線成像，以確保螢光成像過程中小鼠的檢查位置相同。藉助X射線成像，獲得了準確而可靠的螢光數據。如圖4a所示，在第70天，可檢測的螢光信號維持了長達50天，在小鼠的給藥部位未觀察到信號。圖4c顯示了總螢光強度隨時間的定量變化。總的螢光強度隨時間逐漸降低，除了在第2天，由於螢光探針擴散到小鼠表皮。

通過小鼠離體主要器官的螢光成像評估了聚合物水凝膠及其降解產物的體內生物分布。小鼠接受單次注射的RBGel，其中包含高濃度的RB標記的聚合物探針（1.7 mg mL-1），然後在預定的時間點收穫其主要器官。如此高的RB濃度可確保長時間在主要器官中清晰地檢測到該物質及其代謝產物的螢光信號。如圖4b所示，直到第17天，才可以檢測到脾臟，肝臟和膽囊中的螢光信號，這表明PLGA-PEG-PLGA水凝膠及其降解產物主要是通過這些器官消除的。它們的螢光峰強度隨時間的定量變化如圖4d所示。在最初的48小時內，脾臟，肝臟和膽囊的螢光強度急劇增加，隨後逐漸降低。

圖4. a）接受皮下注射MNPs @ RBGel的小鼠的代表性螢光圖像。該圖中顯示的所有數據均來自同一隻滑鼠。b）RBGel處理的小鼠主要器官的代表性螢光圖像。反射率圖像用作背景。c）隨時間變化的小鼠注射總螢光強度的變化。d）小鼠主要器官的螢光峰值強度隨時間的變化。

3. 討論

體內降解行為是可生物降解的生物材料/裝置的重要基礎科學問題。它們的體內命運在獲得所需的治療效果中起著至關重要的作用。解剖學觀察通常用於評估生物可降解材料/裝置在體內的降解過程。然而，這種方法不可避免地涉及到大量動物的使用，並且在整個時期內都無法追蹤到相同的樣本。與傳統的解剖學觀察不同，體內成像技術提供了無創地實時追蹤植入材料/設備的能力，從而實現了在不犧牲任何動物的情況下，根據時間對同一樣品進行縱向監測。甚至某些先進的成像技術也允許訪問植入對象的結構和功能信息。為了確認對PLGA-PEG-PLGA水凝膠的無創追蹤肯定反映了其在體內的真實降解過程，作者使用傳統的解剖學觀察方法在小鼠中進行了平行降解研究（圖6）。

圖6. a）接受皮下注射空白水凝膠的小鼠中剩餘水凝膠的代表性光學照片。虛線用於代表凝膠的邊界。b）剩餘水凝膠的重量比隨時間的變化。c）在預定時間點的乾燥凝膠殘留物的GPC痕跡。d）在預定時間點的乾燥的凝膠殘餘物的1H-NMR譜。

【陳述總結】

在這項研究中，首次通過多種體內成像技術的合作，很好地研究了臨床前PLGA-PEG-PLGA熱敏水凝膠的體內降解行為。RB共價結合到PLGA-PEG-PLGA聚合物的末端以用作螢光探針，並將具有高r2值的CoFe2O4 MNPs加載到凝膠基質中以用作MRI對比。添加兩種探針對水凝膠系統的Tgel及其降解行為均無明顯影響。

皮下注射水凝膠後，通過超聲，螢光和MRI的同步應用對體內降解進行無創監測。將無創成像技術與傳統解剖學觀察相結合，作者揭示了一個三階段降解機制。表面腐蝕在降解的初始階段佔主導地位，然後在第二階段轉變為結合表面腐蝕和PLGA鏈水解的機理。水解控制機制在最後階段起主導作用。溶解的PLGA-PEG-PLGA和降解產物的代謝主要取決於肝臟，膽囊和脾臟。在降解過程中，殘留水凝膠的水含量短暫上升，然後在第25天持續下降，直至達到幾乎恆定的水平。因此，該研究為提供了對PLGA-PEG-PLGA水凝膠降解機理的深入了解。在體內，對於這種水凝膠的未來臨床應用也很有幫助。

【通訊簡介】

俞麟，1996-2000山東大學化學學士，2000-2003南開大學有機化學碩士，2003-2007復旦大學高分子博士，2007-2011復旦大學講師，2011-2016復旦大學副教授，2016-至今復旦大學教授。主要研究生物醫用高分子材料的合成和生物醫用材料領域中的應用研究。曾獲教育部高等學校科學研究自然科學一等獎（項目名稱：可注射性熱致水凝膠，第二完成人，2014.1），第十七屆中國國際工業博覽會創新獎（項目名稱：可注射性熱致水凝膠，2015.11），中國生物材料大會青年科學家獎（2015）。

參考文獻：

doi.org/10.1002/smtd.202000310

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