美國CDC新型冠狀病毒檢測獲FDA緊急使用授權,陰性結果並不排除病毒...

當地時間2月4日晚間，美國食品和藥品監督管理局（FDA）授予了美國CDC新型冠狀病毒快速檢測（2019-nCoV RNA定性實時RT-PCR檢測）的緊急使用授權（Emergency Use Authorization，EUA），用於符合CDC新型冠狀病毒檢測標準患者的診斷。

截至目前，全球報告的2019-nCoV確診病例數近3萬人。鑑於疫情的發展，世界衛生組織總幹事譚德塞於當地時間1月30日在內瓦召開宣布新型冠狀病毒肺炎疫情為「國際關注的突發公共衛生事件」（PHEIC）。隨後，美國衛生與公眾服務部部長、新型冠狀病毒特別工作組主席Alex Azar也於上周五宣布新型冠狀病毒疫情構成美國緊急公共衛生事件。基於以上事件，美國國家免疫和呼吸系統疾病中心中心主任Nancy Messonnier在本周一的媒體簡報中表示，美國CDC於周一向FDA提交了相關檢測的緊急使用授權申請。

此前，美國CDC曾在1月24日公開發布了其rRT-PCR檢測方案。基於該方案，美國CDC已確診了11例新型冠狀病毒感染患者。Nancy Messonnier表示，還有167例確診為陰性的病例以及82例正在等待確診或轉交至CDC實驗室的病例。她指出，美國的病例從輕度到重度不等，但迄今尚無死亡病例。本次rRT-PCR檢測方案獲得FDA批准後，緊急使用授權將允許美國所有CDC認證的實驗室使用這項檢測，將大大增強該國檢測新型冠狀病毒的能力。

據悉，該檢測方案利用逆轉錄PCR方法，可定性檢測來自個體呼吸道和血清標本中的新型冠狀病毒RNA。陽性檢測結果提示可能感染新型冠狀病毒。但值得關注的是，FDA警告說，陰性結果並不能夠排除2019-nCoV感染，而且這些檢測結果不應作為治療或患者管理決策的唯一依據。陰性結果還必須與臨床觀察、患者病史和流行病學信息一起進行評估。

Nancy Messonnier表示：「有些人會認為這意味著該項檢測無法發揮作用。但事實並非如此。這是一種準確的檢測方法。陰性檢測結果很可能意味著一個人沒有被感染；但是，這也可能意味著感染尚未發展到足以被檢測到的程度。」

「情況仍然處於不斷發展過程中，將這項診斷檢測分發至合格的實驗室是保護公眾健康的關鍵一步。」FDA局長Stephen Hahn在一份聲明中表示，「我們與CDC的合作對於快速開發和促進該診斷檢測的獲取至關重要。」

參考資料：

1.FDA Issues Emergency Use Authorization for CDC Novel Coronavirus Test

2. CDC Submitting Novel Coronavirus Test for EUA Following HHS Declaration of Public Health Emergency

附：美國CDC rRT-PCR檢測2019新型冠狀病毒操作說明（中文翻譯）

來源：復旦大學中山醫院檢驗科

簡 介

目的：本文用於實時逆轉錄-聚合酶鏈反應（real-time RTPCR, rRT-PCR）試劑盒體外定性檢測呼吸道和血清標本中2019新型冠狀病毒（2019-nCoV）。針對2019新型冠狀病毒設計引物和探針組合，用於SARS樣冠狀病毒的通用檢測和2019新型冠狀病毒的特異檢測。

方案應用的限制性：除本文所述的平臺或化學方法，其他提及的rRT-PCR檢測尚未經過驗證。

標 本

生物安全注意事項

處理臨床標本時，應穿戴適當的個人防護用品（例如防護服、手套、護目鏡）。標本處理應遵循二級生物安全等級或更高標準，並在經認證的II級生物安全櫃中進行。更多相關信息請參閱：

採集、處理和檢測疑似患者（PUI）臨床標本中2019新型冠狀病毒（2019-nCoV）的暫行準則

https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-nCoV/guidelines-clinical-specimens.html

微生物和生物醫學實驗室的生物安全（第5版）

http://www.cdc.gov/biosafety/publications/

可接受的標本

呼吸道標本包括：鼻咽或口咽抽吸物或洗液、鼻咽或口咽拭子、支氣管肺泡灌洗液、氣管吸出物和痰液。

拭子標本只能用帶有鋁杆或塑料杆的人造合成拭子頭（例如聚酯纖維或滌綸）收集。不允許使用木桿的海藻酸鈣或棉質的拭子頭。

血清

標本處理和儲存

標本採集後在4℃最多保存72小時。

如果不能及時檢測，則將標本在-70 ℃或以下保存。

提取的核酸應在-70℃或以下保存。

標本拒收標準：

標本未保存在2-4℃（≤4天）或冷凍在-70℃及以下。

標本標籤或記錄不齊全。

標本類型不合適。

標本量不足。

試劑、耗材和設備要求

免責聲明：以下列舉的供應商或製造商的產品是適用的，但不代表獲得疾病預防控制中心的認可。

試劑與耗材

實時逆轉錄-聚合酶鏈反應的引物/探針組合

陽性對照

TaqPath1-Step RT-qPCR預混液，CG（ThermoFisher；貨號A15299）

無核酸酶的分子級水

一次性無粉手套

P2/P10、P200和P1000氣溶膠屏障的吸頭

無菌、無核酸酶的1.5 mL微量離心管

0.2 mL PCR反應管條或96孔實時PCR反應板和光學8聯管蓋

實驗室記號筆

適用於1.5 mL微量離心管和96孔0.2 mL PCR反應管的冷卻冰盒

1.5 mL微量離心管架

可接受的表面清潔劑

DNAZapTM（Life Technologies；貨號＃AM9890）

DNA AwayTM（Fisher Scientific；貨號21-236-28）

RNAse AwayTM（Fisher Scientific；貨號21-236-21）

10%的漂白劑（1:10稀釋的5.25%-6.0%次氯酸鈉）

儀器設備

PCR工作站[紫外線燈；層流（100級HEPA過濾）]

渦旋混合器

小型離心機

微量移液器（2或10 L、200 L和1000 L）

多通道微量移液器（5-50 L）

2x96孔冰盒

-20℃（無霜）和-70℃冰箱；4℃冰箱

實時PCR檢測系統

核酸提取系統

核酸提取

基於rRT-PCR擴增技術的檢測性能取決於模板RNA的數量和質量。在檢測標本之前，應鑑定和驗證RNA提取程序的回收率和純度。

已證明可獲得高度純化RNA的商售提取程序包括：bioMérieux NucliSenssystems, QIAamp Viral RNA Mini Kit, QIAamp MinElute Virus Spin Kit 或RNasyMini Kit (QIAGEN), EZ1 DSP Virus Kit (QIAGEN), Roche MagNA Pure Compact RNAIsolation Kit, Roche MagNA Pure Compact Nucleic Acid Isolation Kit, RocheMagNA Pure 96 DNA and Viral NA Small Volume Kit和 Invitrogen ChargeSwitchTotal RNA Cell Kit.

保留剩餘標本和提取的核酸，立即保存至-70℃。

僅復融當天需檢測的核酸標本數量。在測試之前，勿凍融核酸標本超過1次。

質量控制

由於rRT-PCR敏感性高，上述檢測應執行嚴格的質量控制和質量保證程序。遵循以下標準有助於最大程度地減少假陽性擴增的可能。

一般注意事項

檢測人員需熟悉使用檢測流程和儀器。

為檢測試劑配製及核酸提取提供獨立區域和專用設備（例如移液器、微小離心機）和耗材（例如微量離心管、移液器吸頭、防護服和手套）。

工作流程必需始終由清潔區到汙染區。

試劑配製和處理提取核酸時，穿戴乾淨的一次性防護服和未使用過的無粉手套。任何時候若懷疑汙染，請更換手套。

引物/探針和酶預混合物（請參閱說明書）保存在適宜溫度下。請勿使用過期試劑。

儘可能儘快蓋好試劑管蓋和反應體系管蓋。

清潔和消毒表面。

請勿將提取的核酸或PCR產物帶入試劑準備區。

僅使用帶氣溶膠屏障（濾芯）的吸頭。

僅使用PCR板條蓋。不可使用PCR板密封膜。

檢測對照

對照應與所有標本同時檢測。

PTC（陽性對照）-有預期Ct值範圍的陽性模板對照。

NTC（陰性對照）-在rRT-PCR反應開始時加入陰性模板對照。

HSC –與待測標本同時提取的人類標本提取對照；提供核酸提取程序對照和輔助陰性對照以驗證核酸提取程序和試劑的完整性。

RP-檢測所有臨床標本中的人類RNAse P基因以評估標本質量。

*注意：請保留PTC性能運行日誌。在每次運行臨床標本後，應記錄對照的Ct值。

rRT-PCR檢測

庫存試劑準備

rRT-PCR引物/探針組合（若CDC提供，請參閱說明書 ）

注意事項：這些試劑只能在清潔區處理，避光保存於適宜溫度（見下文）。避免反覆凍融。復融後保持低溫。

使用無菌技術，將乾粉試劑重懸於500 μL無核酸酶水（工作濃度為50X），避光於室溫下復溶15分鐘。

輕柔混勻，以100 μL的體積等分引物/探針至5個預先標記的分裝管中。將其中一管引物/探針避光保存於2-8℃。勿重新凍存（穩定期長達4個月）。剩餘分裝管保存於≤-20℃的無霜冰箱中。

陽性對照（PTC）（如果使用CDC陽性對照nCoVPC，請參見CDC提供的說明書）

注意事項：本試劑應在核酸處理區內謹慎處理，避免造成汙染。避免反覆凍融。復融後保存於冰上。

用於評估rRT-PCR的檢測性能。除非已經水溶，否則將每管幹粉試劑重懸於1 mL無核酸酶水中，以得到適合的工作稀釋液。以100 μL的體積將試劑分裝至10個分裝管中，儲存在≤-70°C。

準備nCoVPC的工作稀釋液，復融上述100 μL濃縮的nCoVPC分裝管，以1:10進行稀釋（終體積為1.0 mL）。根據檢測的需求，將稀釋的nCoVPC分裝成適合的規格。將未使用的材料存放在≤-70°C的環境中。

每次實驗需復融單管稀釋的陽性對照，保存於冰上，直至加入反應板中。丟棄未使用完的部分。

nCoVPC也包含人類DNA，可作為RP檢測的陽性對照。

儀器準備

1）首先，使用RNase Away或新配製的10%漂白劑清潔所有工作檯面、移液器、離心機和其他設備。

2）打開AB 7500 Fast DX，將模塊升溫至適宜溫度。

3）在儀器上設置反應板並選擇擴增程序。

4）儀器設置：檢測通道(FAM)；淬滅基團(無)；參比螢光：(無)；運行模式：(標準)；樣本體積(25 L)

*在55℃這一步驟採集螢光信號數據（FAM）

反應體系和反應板設置

注意：反應板設置根據標本數量和工作安排而定。每批次中必須包括NTC和nCoVPCs。

1）在試劑準備區的清潔通風櫃中，將rRT-PCR緩衝液、酶和引物/探針置於冰或冰盒上。在配製和使用過程中保持低溫。

2）使用前將2X反應混合液復融。

3）將緩衝液、酶和引物/探針顛倒混勻5次。

4）短暫離心緩衝液和引物/探針後放回冰上。

5）標記每組裝有引物/探針的1.5mL離心管。

6）確定每次檢測配製的反應數(N)。由於存在移液誤差，需配製NTC、nCoVPC和RP過量的反應體系。根據以下說明確定N：

如果包括對照在內的標本數(n)在1到14之間，則N=n+1

如果包括對照在內的標本數(n)等於或大於15，則N=n+2

7）對於每組引物/探針，計算每個反應需要加入的量。

TaqPath一步法RT-qPCR反應液

8）將試劑分別加入標記的1.5 mL離心管中。加入試劑後，通過移液器吹打混勻反應液。請勿渦旋震蕩。

9）瞬離5秒，將試劑收集至試管底部，然後將離心管放回至冰盒。

10）在96孔冰盒上放置反應條或反應板。

11）將20 L的反應體系按行加入反應孔中，如下所示(圖1)：

圖1：反應板設置示例

12）移動至標本製備區之前，在試劑準備區中準備第1列的NTC。

13）將5 L無核酸酶純水加入NTC樣品孔。在進行下一步操作之前，蓋緊NTC孔的蓋子。

14）密封整塊反應板並將反應板移至標本製備區。

加入模板

1）輕柔地渦旋震蕩核酸標本約5秒。

2）離心後，將核酸標本管放入冰盒中。

3）如圖2所示，應將標本加入第2-11列（第1列和第12列為對照列）試劑中。小心地將5.0 L一號標本加入對應的反應孔中（即在第2列中加入標本「S1」）。在加樣過程中關閉其他反應孔。每次加樣後更換吸頭。

4）蓋緊加完標本的反應列的蓋子，以防止交叉汙染並確保標本溯源性。

5）勤換手套以避免汙染。

6）其餘標本重複步驟3和4。

7）必要時，可將5 L抽提後的HSC加入到HSC孔中（圖2，第11列）。加樣完畢後蓋緊蓋子。

8）密封整塊反應板，並將反應板移動到陽性對照處理區。

加入檢測對照

1）將5 L nCoVPC RNA加入第12列的標本孔中（圖2）。加完RNA對照後蓋緊蓋子。

注意：如果使用8孔反應條，應做相應標記以提示標本位置。

不要在反應管的上方做標記！

2）將反應條瞬離10-15秒，離心完畢後放回冰盒。

注意：如果使用96孔反應板，則將反應板在4℃下，以500 g轉速離心30秒。

圖2. 2019-nCoV rRT-PCR診斷試劑盒：標本和對照設置示例

a必要時，可將本列標本替換為抽提後的HSC。

數據分析

運行完成後，請按照儀器廠商的說明保存並分析數據。手動設定閾值並對每個靶標分別分析。閾值應設在螢光曲線的指數增長期，並高於任何背景信號（請參見圖3）。閾值設定的程序需保持一致。

圖3. 擴增曲線窗口

圖中中英對照翻譯框

Amplification Plot Window：擴增曲線窗口

Exponential PCR Phase：PCR指數期

Background noise：背景幹擾

Threshold adjusted to fall within the PCR exponential phase.：閾值設定在PCR指數增長期內。

檢測結果解釋

NTC應該為負值，螢光擴增曲線不應超過閾值線。

如果一個或多個引物和探針的NTC反應出現假陽性，則可能發生標本汙染。

判定該運行無效，並嚴格遵守操作指南重新檢測。

PTC反應結果應為陽性，且本次檢測的所有靶標的Ct值都應在預期範圍內。

如果未達到預期的陽性結果，則判定該批次檢測無效，並嚴格遵守操作指南重新檢測。

分析PTC反應失敗的原因，採取糾正措施，並記錄調查結果和糾正措施。

勿使用無法產生預期結果的PTC試劑。

對於所有臨床標本和HSC，RP需在≤35個循環呈陽性，提示人RNAse P基因的核酸充足，並且標本質量合格。

無法在HSC中檢測到RNAse P可能提示：

檢測方法設置和運行錯誤。

試劑問題或設備故障。

在HSC中檢測到RNAse P，但在臨床標本中未檢測到RNAse P可能提示：

從臨床標本中提取核酸時操作不當導致核酸丟失或臨床標本中PCR抑制劑殘留。

標本中缺乏足夠的人類細胞以供檢測。

對於2019-nCoV特異性引物/探針組合，HSC應為陰性。

若任意2019-nCoV特異性引物/探針的擴增曲線超過閾值線，則解釋如下：

可能已發生核酸提取試劑的汙染。判定該批次檢測無效，並在進一步檢測之前確認核酸提取試劑的完好性。

在核酸提取步驟或檢測設置過程中發生標本的交叉汙染。判定該批次檢測無效，並嚴格遵守操作指南重新檢測。

對照均呈現預期結果時，若所有2019-nCoV靶標（N1、N2、N3）的擴增曲線均未超過閾值，且RNAse P擴增曲線均超過閾值線，則標本判定為陰性。

對照均呈現預期結果時，若所有靶標（N1、N2、N3）的擴增曲線均超過閾值線，則該標本判定為2019-nCoV陽性。如上所述，RNase P可能是或不是陽性，但2019-nCoV結果仍然有效。

當所有對照均呈現預期結果，且2019-nCoV靶標（N1、N2、N3）和RNAse P靶標的擴增曲線未超過閾值時，結果無效。標本中提取的RNA需重新檢測。若無剩餘RNA，請從剩餘標本中重新提取RNA後，再復檢。若復檢標本的所有靶標均為陰性，但所有對照均呈現預期結果，則結果為「無效」。

當所有對照均呈現預期結果，且任意一個或兩個（N1、N2、N3）（非全部三個）靶標的擴增曲線超過閾值線時，則無法判定2019-nCoV結果。需從剩餘標本中重新提取RNA復檢。

檢測局限性

在檢測之前，需對分析人員進行培訓，並熟悉檢測流程和結果解釋。

採集、運送或處理不當導致的標本中的病毒核酸丟失，則可能會導致假陰性結果。

RNA病毒具有強大的遺傳變異性。儘管已經在努力設計檢測病毒基因組保守區域的rRT-PCR方法，但變異所致的引物和探針與靶序列之間的錯配會導致檢測性能下降和可能的假陰性結果。

· END ·

年

終

回

顧

喜歡別忘了點「在看」！