抗體標記螢光簡單兩步走

2021-01-16 達科為生物城

AAT Bioquest®是螢光探針生產商中的佼佼者,憑藉其創新精神,生產出非常優秀的螢光,便利了科研與發現。

 

Readilink抗體標記試劑盒

簡單快速無需純化,即只需要反應(30-60min)和終止反應(10min)兩步即可。


 

將所有組分恢復室溫並在打開前將樣品瓶短暫離心,並在開始標記前立即準備所需的溶液。 以下操作步驟僅供參考。

 

 

為了標記50μg蛋白質(假設目標蛋白質濃度為1mg / mL),將5μL(總反應體積的10%)的反應緩衝液(組分B)與50μL目標蛋白質溶液混合。

 

注意1.如果您的蛋白質濃度不同,請相應調整蛋白質體積,使約50μg蛋白質可用於標記反應。

 

注意2:要標記100g蛋白質(假設目標蛋白質濃度為1mg / mL),將10μL(總反應體積的10%)反應緩衝液(組分B)與100μL目標蛋白質溶液混合。

 

注意3:蛋白質應溶解於pH7.2-7.4的1X磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中;如果蛋白質溶解在甘氨酸緩衝液中,必須用1X PBS(pH 7.2-7.4)透析,或使用Amicon Ultra-0.5,Ultracel-10膜,10 kDa(來自Millipore的cat#UFC501008)去除廣泛用於蛋白質沉澱的游離胺或銨鹽(如硫酸銨和乙酸銨)。

 

注意4:不純抗體、牛血清白蛋白(BSA)或明膠穩定的抗體不能被很好地標記。


注意5:為獲得最佳標記效率,建議最終蛋白質濃度範圍為1-2 mg / mL。如果蛋白質濃度小於1 mg / mL,則結合效率顯著降低。

 

 2.1將蛋白質溶液(溶液A)加入一瓶標記染料(組分A)中,反覆吹打幾次或渦旋小瓶幾秒將其充分混合。

 

注意:如果要標記100 μg蛋白質,請使用兩個小瓶(組分A),將100 μg蛋白質分成2 x

50 μg蛋白質,並使每個50 μg蛋白質與一小瓶標記染料反應。然後將兩個小瓶合併用於下一步。

 

2.2將結合反應混合物在室溫下孵育30-60分鐘。

 

注意:如果需要,可以旋轉或搖動結合反應混合物更長的時間。

 

 3.1添加5μL(對於50μg蛋白質)或10μL(對於100μg蛋白質)TQ染色猝滅緩衝液(組分C),該緩衝液佔綴合反應混合物反應體積的10%(來自步驟2.2),將它們混合均勻。

 

3.2在室溫下孵育10分鐘。

 

3.3標記的蛋白質(抗體)現在可以使用了。


Buccutite抗體大分子蛋白標記試劑盒


反應快:在5-9的PH範圍內反應1-2小時,形成穩定的抗體螢光結合物。

操作簡便效率高:試劑盒核心成分Buccutite MTA和Buccutite FOL。分別將MTA連接到抗體(蛋白質)中,FOL連接到蛋白螢光或者HRP等蛋白上,再將兩種蛋白混合後連接,即可獲得標記抗體,同時有效避免抗體或蛋白發生自交聯,從而有更高的標記效率。


 

抗體工作液準備

為了標記100 μg抗體(假設目標抗體濃度是1 mg/mL), 將 5 μL (反應總體積的5% ) 反應緩衝液 (組分 C) 與100 μL目標抗體混合。

 

1.Antibody-Buccutite MTA反應

 

1.1將抗體溶液直接加入到Buccutite MTA(組分B)的小瓶中,移液器反覆吹吸幾次或者

渦旋幾秒混勻。

 

1.2將抗體-Buccutite MTA反應混合物在室溫下孵育30-60分鐘。

 

注意:如果需要,抗體-Buccutite MTA反應混合物可以旋轉或搖動更長時間。

 

2.準備純化柱用於抗體-Buccutite MTA純化

 

2.1將提供的純化柱(組分D)反轉幾次以重新懸浮沉降的凝膠並去除任何氣泡。

 

2.2取下尖端並將純化柱放入洗滌管(2 mL,未提供)中。取下蓋子,讓多餘的填料緩衝液通過重力排放到凝膠床的頂部。如果純化柱沒有開始流動,請將蓋子推回純化柱並再次將其取出以開始流動。丟棄排出的緩衝液,然後將純化柱放回洗滌管中。但是,如果將純化柱放入12 x 75 mm試管(未提供)中,請立即離心。

 

2.3在搖動式離心機中以1,000×g離心2分鐘(參見「離心注意事項」部分)以除去包裝緩衝液。丟棄緩衝液。


2.4向柱中加入1-2 mL 1X PBS(pH 7.2-7.4)。每次添加PBS後,讓緩衝液通過重力排出,或將純化柱離心2分鐘以除去緩衝液。丟棄收集管中的緩衝液。重複此過程3-4次。

 

2.5在搖動式離心機中以1,000×g離心2分鐘(參見「離心注意事項」部分)以除去包裝緩衝液。丟棄緩衝液。

 

 

3.1將柱(來自步驟準備純化柱用於抗體-Buccutite MTA純化)置於乾淨的收集管(1.5mL,未提供)中。小心地將樣品(約105μL,來自Step Antibody-Buccutite MTA反應)直接加載到純化柱中心。

 

3.2上樣後,加入5μL 1XPBS(pH 7.2-7.4),使總體積為110μL。將柱以1,000xg離心5-6分鐘,並收集含有所需抗體-Buccutite MTA溶液的溶液。

 

 

4.1通過向Buccutite FOL活化的PE(組分A)的小瓶中加入50μL ddH2O製備Buccutite FOL活化的PE溶液,移液槍反覆吹吸幾次充分混合,或者將小瓶渦旋幾秒鐘混勻。

 

4.2將整瓶Buccutite FOL活化的PE溶液混合到純化的抗體-Buccutite MTA溶液(來自步驟純化抗體-Buccutite MTA溶液)中,充分混合併在室溫下旋轉混合物1小時。

 

4.3抗體-PE結合物現在可以使用了。

 

注意:立即使用時,抗體-PE結合物需要用您選擇的緩衝液稀釋。

 

注意:對於長期儲存,需要濃縮或冷凍乾燥抗體-PE結合物溶液。

 

 

抗體結合物應在載體抗體(例如0.1%牛血清白蛋白)存在下以> 0.5mg / mL儲存。當在2mM疊氮化鈉存在下儲存並避光時,抗體-PE綴合物溶液可以在4℃下儲存兩個月而沒有顯著變化。對於更長時間的儲存,可以將抗體-PE綴合物凍幹並在≤-20℃下儲存。


 

6.1純化柱(組分D)可以裝入2mL微量離心管或12×75mm試管中,用於在離心過程中收集樣品。使用2 mL微管和純化柱進行初始平衡步驟。

 

6.2能夠產生1,000 x g的最小力的擺動式離心機適用於Bio-Spin柱。在特定轉速下產生的重力是微量離心機轉子半徑的函數。有關從每分鐘轉數(RPM)到離心力或g力的轉換信息,請參閱擺動式離心機說明手冊。或者,使用以下等式計算達到1,000 x g重力所需的RPM速度。

 

6.3 RCF(xg)=(1.12 x 10-5)×(RPM)×2×r(RCF是相對離心力,r是從轉子中心到Bio-Spin柱中間測量的以釐米為單位的半徑 ,RPM是轉子的速度)。

AAT是美國螢光染料研發生產的高精鑽企業,為全球的研究機構以及生產機構提供了質量高,性價比高的螢光產品。此次疫情中,AAT為新冠病毒的核酸檢測試劑盒的開發,提供了優質的 ROX TET HEX等染料。品質在,所以安心。

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