隨著年齡的增長，人體皮膚的修復能力會逐漸減弱，這一現象在老年人上尤為明顯。老年人皮膚傷口常常出現癒合速度慢，愈後結疤瘢等現象，嚴重減低著老年人的生活質量。近年來，研究發現間充質幹細胞分泌的EGF、FGF2、IGF、PDGF、VEGF、IL-1、IL-10等多種細胞因子能夠明顯促進傷口癒合，這些細胞因子通過促進細胞增殖、分化、血管生成、抑制炎症反應等幾個方面參與皮膚組織生成。間充質幹細胞分泌因子不僅可繞過與細胞治療有關的免疫相容性、疾病傳染性等問題，還可以批量生產，長期保存，降低細胞培養所需的時間和成本，因此間充質幹細胞分泌因子對於創傷、腦缺血、心肌梗塞等疾病的治療更具優勢。但間充質幹細胞分泌因子成分複雜，各細胞因子通過何種方式發揮促進老化皮膚創傷癒合的詳細調控機制目前尚不可知，這在一定程度上抑制間充質幹細胞分泌因子的臨床應用。因此，探究真皮間充質幹細胞分泌因子治療老化皮膚創傷的相關分子機制具有十分重要的意義。
成纖維細胞是皮膚創傷中主要的修復細胞，當皮膚發生創傷時，成纖維細胞在多種細胞因子的刺激下，會大量增殖，遷移並分泌膠原蛋白及細胞外基質填補創傷部位，從而達到促進傷口癒合的目的。實驗採用卡波姆為凝膠基質，添加富含真皮間充質幹細胞分泌因子的條件培養液，製成分泌因子凝膠劑，治療老化小鼠皮膚創傷，闡明真皮間充質幹細胞分泌因子通過激活細胞內ErK1/2信號通路，加快真皮成纖維細胞增殖，促進老化皮膚創傷癒合，不僅為幹細胞相關製劑的研發提供技術手段，也為幹細胞相關製劑的臨床應用提供理論基礎。
1 材料與方法
1.1 試驗動物
試驗動物為SPF級野生型129/SvJ小鼠，購自韓國生命工學院。8月齡野生型小鼠12隻，雌雄各半，自由飲食，室溫控制在25益左右，12h暗/光周期飼養。所有的動物程序都是按照KRIBB機構動物護理和使用委員會的規定進行的。
1.2 主要試劑
蘇木精試劑，購買自上海蘭秀公司；伊紅試劑，購買自天津大茂化學公司；硫酸鐵銨、酸性品紅、磷鉬酸、苯胺藍試劑，購買自阿拉丁化學公司；高熔點石蠟，購買自德國Leica公司；卡波姆940，購買自麥克林公司；蛋白免疫印跡相關試劑，購買自Amresco公司；PCNA、Cyclin-D1、ErK、p-Erk抗體，購買自美國SantaCruz公司；DMEM，購買自索萊寶公司；胎牛血清，購買自索萊寶公司。
1.3 方法
1.3.1小鼠真皮間充質幹細胞條件培養基的製備
將真皮間充質幹細胞從液氮罐中取出，復甦至10cm細胞培養皿，使用含有10%胎牛血清（FBS）、1%青黴素和鏈黴素（P/S）的DMEM培養液培養，放入37益、含5%二氧化碳（CO2）的恆溫培養箱中。6h後觀察細胞貼壁情況。當細胞生長至細胞融合率達70%~80%時，棄去原來培養液，更換培養液繼續培養並加入100滋LNEAA以及10滋LB27，培養12h後收集真皮間充質幹細胞培養上清液，將回收的真皮間充質幹細胞上清液以2000rpm，離心10min，0.22滋m濾膜過濾去除細胞碎片。即獲得真皮間充質幹細胞條件培養基，以每管1mL進行分裝，儲存在-80益冰箱用於後續實驗。
1.3.2卡波姆凝膠劑的製備
首先用電子天平稱取0.04g卡波姆加入4mL濃度為0.1mol·L-1的NaOH溶液，再加入11mL蒸餾水，溶脹過夜。第二天呈膠凍狀，加入真皮間充質幹細胞條件培養基5mL攪拌均勻，進行分裝，分裝後置於冰箱4益保存，用於後續實驗。
1.3.3老化小鼠皮膚創傷實驗
採用8月齡老齡鼠12隻，採用0.25%Avertin進行腹腔注射，用於麻醉小鼠，對小鼠背部皮膚5cm伊5cm區域進行脫毛處理，先用推子剃去長毛髮，再塗抹脫毛膏去除短的毛髮，擦去多餘脫毛膏，採用酒精、碘伏對脫毛區進行消毒，選取距脊柱1cm的腰後部位置，製作直徑為5mm的圓形傷口。分泌因子組小鼠每天定時定量塗抹製作的真皮間充質幹細胞分泌因子凝膠，空白對照組小鼠不進行處理，將每隻小鼠單籠餵養，自由進食，連續9d拍照觀察，對創面面積進行統計學分析。
1.3.4MTTassay分析
將離心後的真皮成纖維細胞加入培養液，吹打混勻，以1伊104個/mL的濃度種於96孔板中，每孔加入100滋L細胞懸液，置於5%CO2，37益恆溫培養箱中培養12h後，將空白對照組與真皮間充質幹細胞條件培養基組分別更換含2%FBS的DMEM以及之前製備好的真皮間充質幹細胞條件培養基，每孔加入100滋L。於培養箱中培養24h後，每孔加入10滋LMTT，置於培養箱中孵育4h，棄掉培養液後每孔加入100滋LDMSO混勻，避光孵育10min，酶標儀檢測570nm處的吸光度值，並對所得實驗數據進行統計學分析。
1.3.5統計學分析
實驗數據以「平均值依標準差」表示，組間差異採用t檢驗，P<0.05為有統計學差異，P<0.01為有顯著統計學差異，P<0.001為有極其顯著的統計學差異，所有數據ImageJ軟體進行統計學分析。每組實驗均重複3次。
2 結果
2.1真皮間充質幹細胞分泌因子凝膠劑能促進老化
皮膚創傷癒合為研究真皮間充質幹細胞（DMSCs）分泌因子對衰老小鼠創傷癒合的影響，採用DMSCs分泌因子凝膠劑處理衰老小鼠皮膚全層切除模型，觀察衰老小鼠創傷癒合的情況。結果表明，分泌因子凝膠組在癒合過程中傷口面積明顯小於空白對照組（圖1A），經統計學分析，分泌因子組的傷口面積顯著低於空白對照組（圖1B），H&E染色結果表明，第9d時，各組均有肉芽組織填埋傷口，分泌因子凝膠組創面已被填埋，上皮完整，癒合基本完成；空白對照組上皮較薄，再生不完全（圖1C）。表明真皮間充質幹細胞分泌因子凝膠劑能夠促進老化皮膚創傷癒合。
2.2真皮間充質幹細胞條件培養基能促進真皮成纖維細胞增殖
為了探究DMSCs分泌因子促進老化皮膚創傷癒合的機制，採用含有DMSCs分泌因子的條件培養基處理真皮成纖維細胞，利用MTT法檢測真皮成纖維細胞的細胞活力；利用蛋白質免疫印跡法檢測增殖相關蛋白PCNA、CyclinD1表達水平。結果表明，與空白對照組相比，DMSCs條件培養基組處理後的真皮成纖維細胞的細胞活力顯著增加（圖2A），增殖相關蛋白PCNA、CyclinD1表達水平顯著上升（圖2B）。表明DMSCs條件培養基能促進真皮成纖維細胞增殖。
2.3真皮間充質幹細胞分泌因子通過ErK1/2信號
通路促進真皮成纖維細胞增殖ErK1/2是MAPK信號通路的重要成員，通過磷酸化其底物，參與細胞增殖、應激、分化、凋亡和炎症的調控。為了探究DMSCs分泌因子促進真皮成纖維細胞增殖的分子機制，在分子水平上檢測真皮成纖維細胞內ErK1/2，p-ErK1/2蛋白表達水平。結果表明，與空白對照組相比DMSCs條件培養基組pErK1/2表達水平顯著上升，ErK1/2表達水平基本不變（圖3）。這說明，真皮間充質幹細胞分泌因子可以通過調節真皮成纖維細胞內的ErK1/2信號通路促進真皮成纖維細胞增殖。
3討論
隨著全世界老齡化人口數量的不斷增加，老年群體創傷發生率越來越高，值得關注的是常規治療創傷的方法對於老年創傷患者治療效果並不明顯。因此，探究有效治療老化皮膚創傷的方法具有重要意義。研究表明，間充質幹細胞對皮膚創傷具有良好的治療效果，無論是內源性幹細胞還是移植的外源性幹細胞均能起到促進傷口癒合的作用。起初人們認為，間充質幹細胞治療傷口癒合主要是通過自身的增殖、分化來替代和補充受損傷的細胞，但最新的研究表明，移植的外源性間充質幹細胞在傷口部位存活率較低，也極少會分化成其他的細胞，同時發現即使植入的間充質幹細胞遠離實際損傷部位，但仍可以促進傷口癒合，因此研究人員認為間充質幹細胞是可能通過旁分泌的方式發揮治療效果。
在皮膚創傷癒合過程中，真皮成纖維細胞被認為是參與皮膚組織再生的主要細胞，它參與了皮膚創傷癒合一些關鍵的過程。在炎症階段結束增殖階段開始時，真皮成纖維細胞會快速增殖，然後分泌多種基質金屬蛋白酶來膨脹和降解纖維蛋白凝塊，並將其替換為細胞外基質成分，如膠原蛋白IIV、XVIII、糖蛋白、蛋白聚糖、層粘連蛋白、血小板反應蛋白、糖胺聚糖（GAGs）、透明質酸（HA）和硫酸肝素。這種複雜的基質支持並調控成纖維細胞的遷移和活性，同時也為血管生成、肉芽組織生成和上皮化提供支持和信號，進而促進皮膚創傷癒合。研究表明脂肪間充質幹細胞條件培養基（ASCs-CM）中bFGF、EGF均可顯著促進真皮成纖維細胞的增殖。骨髓間充質幹細胞能分泌特殊的細胞因子如VEGF，igf-1，EGF等對傷口癒合很重要的細胞因子促進真皮成纖維細胞的增殖和遷移。臍帶間充質幹細胞（MSCs）條件培養液能夠促進皮膚組織損傷修復，且經ELISA測定，條件培養液中含有高濃度VEGF、IL-8、MCP-1生物活性因子。這與實驗的結果相一致，研究採用真皮間充質幹細胞分泌因子凝膠劑治療老化皮膚創傷，結果顯示分泌因子凝膠組傷口癒合率顯著高於空白對照組；採用MTT法檢測真皮間充質幹細胞分泌因對真皮成纖維細胞增殖能力的影響，結果顯示分泌因子組真皮成纖維細胞的增殖速度明顯高於空白對照組。這表明，真皮間充質幹細胞分泌因子凝膠劑通過幹細胞分泌的多種分泌因子促進成纖維細胞
增殖加快老化皮膚創傷癒合。研究顯示FGF和TGF茁-1誘導的成纖維細胞增殖，並均能夠被ErK1/2特異性抑制劑所消除，同時，實驗的研究結果也表明幹細胞條件培養基處理真皮成纖維細胞，細胞內的P-ErK1/2表達水平明顯升高。綜合以上的結果表明，真皮間充質幹細胞分泌因子可能是通過激活成纖維細胞內ERK1/2信號通路，加快細胞增殖，促進老化皮膚傷口癒合。同時實驗推測ErK1/2信號通路可能是多種細胞因子調控成纖維細胞增殖的共同下遊信號通路，這將是下一步研究的重點。
由於含有間充質幹細胞分泌因子的條件培養基為液體，不能長時間停留在傷口表面，嚴重抑制幹細胞相關產品的治療效果。因此，需要選用一種能夠承載幹細胞條件培養基的藥物，使得培養基內的細胞因子更好的進入皮膚傷口部位，發揮治療效果。實驗採用卡波姆為凝膠基質，卡波姆是主要用於皮膚治療劑的藥物輔料，是國家藥典中規定的藥物輔料，是多種凝膠基質生物黏附材料、控緩釋製劑的骨架材料等。以卡波姆為基質製作的凝膠劑易塗展、無油膩性，附著性和均勻性良好，對皮膚和黏膜無刺激性且使藥物呈零級或近似零級釋放，能最大限度維持藥物療效。因此，研究通過製備真皮間充質幹細胞分泌因子凝膠劑，探究幹細胞分泌因子對老化皮膚創傷癒合的影響，闡明真皮間充質幹細胞分泌因子通過ErK1/2信號通路促進真皮成纖維細胞增殖加速老化皮膚創傷癒合的作用，為治療老化皮膚創傷提供新思路。
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