Leptin Receptor Promotes Adipogenesis and Reduces Osteogenesis by Regulating Mesenchymal Stromal Cells in Adult Bone Marrow
作者：Yue R, Zhou BO, Shimada IS, Zhao Z, Morrison SJ(Howard Hughes Medical Institute Department of Pediatrics and Children’s Research Institute University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas, TX 75390, USA)
發表情況：Cell Stem Cell. 2016 Jun 2;18(6):782-96. pii: S1934-5909(16)00105-3. doi: 10.1016/j.stem.2016.02.015.
1、瘦素/瘦素受體對成骨和成脂分化有著怎樣的調控作用？
2、瘦素/瘦素受體對成骨和成脂分化的調控作用，究竟是通過下丘腦神經元的中樞作用、還是通過骨髓基質細胞的外周作用？
1、在肢芽幹細胞中條件性敲除瘦素受體後，四肢骨骨形成增強、脂肪形成減弱，同時骨折癒合加速；
2、瘦素/瘦素受體信號通路通過骨髓中的間充質間質細胞響應飲食和肥胖，調控脂肪形成和骨形成；
3、瘦素/瘦素受體通過激活Jak2/Stat3通路，調控骨髓中間充質間質細胞的分化。
骨骼幹細胞（SSC）是成人骨髓中成骨細胞和脂肪細胞的主要來源，它表達瘦素受體（LepR）。為了研究LepR是否調控SSC的功能，我們使用四肢骨骨髓基質細胞中的Prx1 - Cre 條件性地敲除Lepr ，但沒有從中軸骨或下丘腦神經元中敲除。Prx1 - Cre ; Leprfl / fl小鼠表現出正常的體重和造血功能。然而，來自Prx1 - Cre ; Leprfl / fl小鼠的四肢骨表現出增強的骨形成、減弱的脂肪形成和加速的骨折癒合。瘦素通過激活骨髓基質細胞中的Jak2 / Stat3信號傳導來增加脂肪形成同時減少骨形成。在野生型小鼠中，高脂飲食（HFD）會增加四肢骨的脂肪形成和減少骨形成，在Prx1 - Cre ; Leprfl / fl小鼠中則未觀察到這一現象。這反映了LepR對骨髓基質細胞成骨和成脂的局部作用以及對骨吸收的全身作用。瘦素/ LepR信號通路通過骨髓間充質基質細胞響應飲食和肥胖，調控成脂和成骨分化。
Skeletal stem cells (SSCs) that are the major source of osteoblasts and adipocytes in adult bone marrow express leptin receptor (LepR). To test whether LepR regulates SSC function, we conditionally deleted Lepr from limb bone marrow stromal cells, but not from the axial skeleton or hypothalamic neurons, using Prx1-Cre. Prx1-Cre;Leprfl/fl mice exhibited normal body mass and normal hematopoiesis. However, limb bones from Prx1-Cre;Leprfl/fl mice exhibited increased osteogenesis, decreased adipogenesis, and accelerated fracture healing. Leptin increased adipogenesis and reduced osteogenesis by activating Jak2/Stat3 signaling in bone marrow stromal cells. A high-fat diet increased adipogenesis and reduced osteogenesis in limb bones from wild-type mice, but not from Prx1-Cre;Leprfl/fl mice. This reflected local effects of LepR on osteogenesis and adipogenesis by bone marrow stromal cells and systemic effects on bone resorption. Leptin/LepR signaling regulates adipogenesis and osteogenesis by mesenchymal stromal cells in the bone marrow in response to diet and adiposity.
圖1 從四肢骨的骨髓SSC中條件性敲除Lepr不會導致肥胖
（A和B）來自Prx1-Cre;tdTomato小鼠的股骨骨髓細胞，顯示了LepR+ CD45- Ter119- CD31- SSCs 中loxp - tdTomato報告基因的重組（n = 3隻小鼠，來自三次獨立實驗）。（C）在Prx1-Cre;tdTomato小鼠的股骨中，LepR和tdTomato抗體染色的共定位；顯示了tdTomato小鼠（n = 3隻小鼠，來自三次獨立實驗）。（D）Prx1 - Cre ; Leprfl/fl及與其性別匹配的同窩對照小鼠中，從股骨骨髓分選出的PDGFRα+ CD45- Ter119- CD31- SSC中Lepr轉錄水平的qPCR分析（n =3次獨立實驗）。（E）野生型和Prx1-Cre;Leprfl/fl小鼠的股骨骨髓細胞的抗LepR抗體染色（n = 每種基因型4隻小鼠，來自四次獨立實驗）。（F）野生型和Prx1-Cre;Leprfl/fl小鼠股骨切片的抗LepR抗體染色（n = 每種基因型3隻小鼠，來自三次獨立實驗）。（G）10周齡和6月齡小鼠的體重（n = 每種基因型7~11隻小鼠，來自七次獨立實驗）。（H）禁食24小時後，10周齡和6月齡小鼠的每日食物攝入量（n = 每種基因型10~12隻小鼠，來自六次獨立實驗）。（I-K）自由進食條件下，10周齡和6月齡小鼠的血糖、血漿瘦素和胰島素水平（n = 每種基因型8~10隻小鼠，來自六次獨立實驗）。（L-O）禁食4小時後，10周齡和6月齡小鼠的葡萄糖耐量和胰島素耐量（n = 每種基因型6~10隻小鼠，來自四次獨立實驗）。
圖2 條件性敲除骨髓SSC中的Lepr， 成骨分化增強、成脂分化減弱
（A-P）所有數據（均值±SD）均反映了6月齡Prx1-Cre;Leprfl/fl及與其性別匹配的同窩對照小鼠的股骨骨髓的情況。在不同的實驗中檢測了不同性別的情況，以使大多數數據能夠同時反映出雄性和雌性小鼠的情況。進行配對統計分析以評估性別匹配同窩仔之間差異的顯著性。（A）成纖維細胞集落（CFU-F）的數量（n = 每種基因型8隻小鼠，來自六次獨立實驗）。（B）PDGFRα + CD45- Ter119- CD31- 的SSCs，摻入BrdU 14天後的情況（n = 每種基因型3隻小鼠，來自三次獨立實驗）。（C）實驗鼠及其同窩對照小鼠股骨幹骺端骨小梁的代表性microCT圖像。（D-J）實驗鼠及其同窩對照小鼠股骨幹骺端骨小梁體積/總體積（D）、骨小梁數量（E）、厚度（F）、間距（G）、連接密度（H）、結構模型指數（I）以及骨密度（J）的microCT分析。（K-M）實驗鼠及其同窩對照小鼠股骨幹骺端鈣黃綠素雙標圖像（K）的代表性結果，顯示了骨小梁礦物質沉積（L）和骨小梁形成率（M）的量化結果（n = 每種基因型9隻小鼠，來自六次獨立實驗）。（N）基於尿液中脫氧吡啶並啉/肌酐比值的骨吸收率分析（n = 每種基因型8隻小鼠，來自六次獨立實驗）。（O and P）代表性的股骨切片脂蛋白和骨橋蛋白染色（O）圖，以及每平方毫米脂肪細胞數的定量分析（P）（n = 每種基因型8隻小鼠，來自六次獨立實驗）。
圖3 敲除成骨細胞中的Lepr不影響成骨和成脂分化
（A-T）所有數據（均值±SD）均反映了6月齡Col2.3-Cre;Leprfl/fl及與其性別匹配的同窩對照小鼠的股骨骨髓的情況。在不同的實驗中檢測了不同性別的情況，並進行了配對統計分析。
（A）CFU-F的數量（n = 每種基因型8隻小鼠，來自六次獨立實驗）。（B）PDGFRα + CD45- Ter119- CD31- 的SSCs，摻入BrdU 14天後的情況（n = 每種基因型3隻小鼠，來自三次獨立實驗）。（C）實驗鼠及其同窩對照小鼠股骨幹骺端骨小梁的代表性microCT圖像。（D-J）實驗鼠及其同窩對照小鼠股骨幹骺端骨小梁體積/總體積（D）、骨小梁數量（E）、厚度（F）、間距（G）、連接密度（H）、結構模型指數（I）以及骨密度（J）的microCT分析（n = 每種基因型8隻小鼠，來自六次獨立實驗）。（K-M）實驗鼠及其同窩對照小鼠股骨幹骺端鈣黃綠素雙標圖像（K）的代表性結果，顯示了骨小梁礦物質沉積（L）和骨小梁形成率（M）的量化結果（n = 每種基因型9隻小鼠，來自六次獨立實驗）。（N）基於尿液中脫氧吡啶並啉/肌酐比值的骨吸收率分析（n = 每種基因型8隻小鼠，來自六次獨立實驗）。（O and P）代表性的股骨切片脂蛋白和骨橋蛋白（OPN）染色（O）圖，以及每平方毫米脂肪細胞數的定量分析（P）（n = 每種基因型8隻小鼠，來自六次獨立實驗）。（Q-T）以克隆密度分選出PDGFRα +CD105+ CD45- Ter119- CD31- SSCs以形成CFU-F、持續8天，接著分別進行成脂或成骨分化4或7天。在整個實驗過程中，一半的細胞中補充有1μg/ ml重組的瘦素蛋白。通過油紅O染色定量含脂肪細胞的克隆數（Q）及每個克隆所含脂肪細胞的平均數（R）。通過鹼性磷酸酶染色定量含成骨細胞的克隆數（S）及每個克隆所含成骨細胞的平均數（T）（n = 3次獨立實驗）。
圖4 LepR在局部介導高脂飲食（HFD）對股骨骨丟失和脂肪形成的影響
（A-N）所有數據（均值±SD）均反映了5-6月齡Prx1-Cre;Leprfl/fl及與其性別匹配的同窩對照小鼠的股骨骨髓的情況。這些小鼠從2-3月齡開始給予高脂或低脂飲食（LFD），持續3個月。
（A-C）經過3個月的HFD或LFD後，實驗鼠及其對照的體重（A）、血漿瘦素水平（B）和CFU-F形成率（n = 每種基因型8隻小鼠，來自八次獨立實驗）。（D-I）實驗鼠及其同窩對照股骨幹骺端骨小梁體積/總體積（D）、骨小梁數量（F）、厚度（G）、間距（H）、骨表面積/骨體積（I）的microCT分析，以及代表性的microCT圖像（E）（n = 每種基因型8隻小鼠，來自八次獨立實驗）。（J and K）實驗鼠及其同窩對照股骨幹骺端骨小梁礦物質沉積（L）和骨小梁形成率（M）的量化結果（n = 每種基因型8隻小鼠，來自八次獨立實驗）。（L）基於尿液中脫氧吡啶並啉/肌酐比值的骨吸收率分析（n = 每種基因型8隻小鼠，來自八次獨立實驗）。（M and N）脂肪細胞的定量（M），以及代表性的股骨切片脂蛋白和OPN染色（N）圖（n = 每種基因型8隻小鼠，來自八次獨立實驗）。
圖5 LepR負調控骨折癒合
（A-J）該組數據反映了3月齡Prx1-Cre;Leprfl/fl雄鼠及其雄性同窩對照的情況，所有數據均為均值±SD。（A and B）骨折1周後，骨折部位附近骨髓腔的HE（A）和番紅O染色（B）圖。
（C and D）骨折2周後，骨折骨痂的HE（C）和番紅O染色（D）圖。（E and F）骨折2周後，骨痂（E）及骨折部位附近剖面圖（F）的代表性microCT圖像。（G-J）骨折2周後，實驗鼠及其同窩對照的骨小梁體積/總體積（G）、骨小梁數量（H）、厚度（I）和間距（J）的microCT分析（n = 每種基因型3-6隻小鼠，來自三次獨立實驗）。
圖6 LepR負調控輻射後的成骨分化
（A-K）該組數據（均值±SD）反映了3月齡Prx1-Cre;Leprfl/fl雄鼠及其雄性同窩對照經過亞致死照射2月後的情況。（A and B）股骨切片脂蛋白和OPN的染色圖（A）以及脂肪細胞數的定量（B）（n = 每種基因型4隻小鼠，來自四次獨立實驗）。（C）亞致死照射2月後，實驗鼠及其對照股骨幹骺端骨小梁結構的代表性microCT圖像。（D-K）實驗鼠及其對照股骨幹骺端的骨小梁體積/總體積（D）、骨小梁數量（E）、厚度（F）、間距（G）、骨小梁表面積/骨體積（H）、連接密度（I）、結構模型指數（J）和骨密度（K）的microCT分析（n = 每種基因型3-6隻小鼠，來自三次獨立實驗）。
圖7 瘦素通過激活Jak2/Stat3通路，在體內外調控SSC的分化
（A）來自6月齡Prx1-Cre;Leprfl/fl雄鼠及其雄性同窩對照股骨未培養的PDGFRα + CD45- Ter119- CD31- 的SSCs信號通路的免疫印跡分析。（n=3次獨立實驗）。（B and C）在含或不含10μM Stat3抑制劑STA-21或1μg/ml重組瘦素蛋白的條件下，成脂分化4天或成骨分化7天的野生型SSCs的集落分化情況（n=3次獨立實驗）。（D-M）該組數據（均值±SD）反映了3-4月齡Prx1-Cre;Jak2V617F及其同性別同窩對照股骨的情況。（D）CFU-F的數量（n = 每種基因型6隻小鼠，來自六次獨立實驗）。（E）股骨長度（n = 每種基因型6隻小鼠，來自六次獨立實驗）。（F）實驗鼠及其對照股骨幹骺端骨小梁的代表性microCT圖像。（G-L）實驗鼠及其對照股骨幹骺端的骨小梁體積/總體積（G）、骨小梁數量（H）、厚度（I）、間距（J）、連接密度（K）和骨密度（L）的microCT分析（n = 每種基因型6隻小鼠，來自六次獨立實驗）。（M and N）股骨切片中脂肪細胞數的定量（M）以及脂蛋白和OPN的代表性染色圖（N）（n = 每種基因型6隻小鼠，來自六次獨立實驗）。（O）來自6月齡Prx1-Cre;Leprfl/fl及其同性別同窩對照股骨未培養的PDGFRα + CD45- Ter119- CD31- 細胞成脂或成骨分化調控子轉錄水平的qPCR分析（n=三次獨立實驗）。