Metformin Limits Osteoarthritis Development and Progression through Activation of AMPK Signaling
Annals of the Rheumatic Diseases， Mar 2020
研究團隊：Jun Li, Bin Zhang, Weixiao Liu, Ke Lu, Haobo Pan, Tingyu Wang, Chundo Oh, Dan Yi, Jian Huang, Lan Zhao, Guangzhi Ning, Cong Xing, Guozhi Xiao, Ru Liu-Bryan, Shiqing Feng, and Di Chen
（Department of Orthopedic Surgery, Rush University Medical Center, Chicago, IL, 60612, USA）
目的：本研究探討二甲雙胍對骨關節炎發生發展的影響。
方法：選用10周齡野生型和AMPK 基因敲除小鼠並進行DMM骨關節炎造模，在DMM手術前2周及術後2周開始服用二甲雙胍(每天4毫克飲用水)。分別於DMM術後6周和12周處死小鼠。通過μ-CT、組織學和疼痛相關行為等試驗方法檢測OA的相關表型。免疫組化和免疫螢光檢測AMPKα1的表達，通過μ-CT和磁共振檢測靈長類動物中的OA相關表型。
結果：二甲雙胍上調關節軟骨組織中磷酸化AMPK和總AMPK的表達。DMM術後6周和12周觀察到輕度和重度的軟骨退變，主要表現為OARSI評分明顯增加，軟骨區域面積的縮小。在DMM手術前及手術後開始應用二甲雙胍均可顯著減少軟骨退變。DMM手術後6周和12周均可觀察到明顯的滑膜增生和骨贅形成，DMM手術前及手術後使用二甲雙胍均可明顯抑制這些病理改變。然而二甲雙胍對AMPKα1基因敲除小鼠OA的病理進展無保護作用，提示二甲雙胍的軟骨保護作用是通過AMPK信號介導的。此外，本研究證實了二甲雙胍在靈長類PMM動物模型中同樣可以預防OA進展。
結論：本研究提示二甲雙胍可以阻止創傷性OA動物模型中骨關節炎的發生和發展。
Objectives In this study, we aim to determine the effect of metformin on OA development and progression.
Methods DMM surgery was performed in 10-week-old WT and AMPK α1 KO mice. Metformin(4 mg/day in drinking water) was given, commencing either 2 weeks before or 2 weeks after DMM surgery. Mice were sacrificed 6- and 12-weeks after DMM surgery. OA phenotype was analyzed by μCT, histology and pain-related behavior tests. AMPKα1 expression was examined by IHC and IF analyses. The OA phenotype was also determined by μCT and MRI in nonhuman primates.
Results Metformin upregulated phosphorylated and total AMPK expression in articular cartilage tissue. Mild and more severe cartilage degeneration was observed at 6 and 12 weeks after DMM surgery, evidenced by markedly increased OARSI scores, as well as reduced cartilage areas. The administration of metformin, commencing either before or after DMM surgery, caused significant reduction in cartilage degradation. Prominent synovial hyperplasia and osteophyte formation were observed at both 6- and 12-weeks after DMM surgery; these were significantly inhibited by treatment with metformin either before or after DMM surgery. The protective effects of metformin on OA development were not observed in AMPKα1 KO mice, suggesting that the chondro-protective effect of metformin is mediated by AMPK signaling. In addition, we demonstrated that treatment with metformin could also protect from OA progression in a PMM animal model in non-human primates.
Conclusions The present study suggests that metformin, administered shortly after joint injury, can limit OA development and progression in injury-induced OA animal models.
Figure 1. 二甲雙胍延緩小鼠內側半月板失穩(DMM)骨關節炎模型中骨關節炎的發生與發展。(A) DMM手術後6周及12周小鼠膝關節骨關節炎的組織學表現。黃色箭頭表示關節軟骨退化；綠色箭頭表示骨贅；紅色箭頭表示滑膜增生。(B，G)採用國際骨骨關節炎研究協會(OARSI)評分系統對股骨內側髁(MFC)和脛骨內側平臺(MTP)組織切片進行分級，分析OA軟骨退變的嚴重程度。(C，H)用Osteo Measure系統追蹤阿爾新藍陽性染色面積，定量MFC和MTP的關節軟骨面積。(D，I)滑膜炎症程度用滑膜襯裡層數半定量。(E，F，J，K)骨贅形成評分由大小(E，F)和成熟度(J，K)兩個區域組成。n=7。(L，M)應用微電腦斷層掃描(μCT)分析二甲雙胍治療後6周和12周小鼠的骨贅形成情況。測量鈣化的半月板和滑膜組織的體積。
Figure 2. 二甲雙胍誘導AMP活化蛋白激酶(AMPK)磷酸化和表達。
(A)用免疫組織化學(IHC)方法分析假手術組、內側半月板失穩手術組中(內側半月板手術後6周或12周)二甲雙胍治療後的膝關節切片中AMPK的表達。並對股骨和脛骨軟骨非鈣化區的陽性細胞進行進一步統計分析。(B，C)p-AMPKα和總AMPKα染色陽性細胞(n=3)。
結果顯示，二甲雙胍可上調磷酸化AMPKα和總AMPKα的表達。
Figure 3. AMPK介導二甲雙胍的軟骨保護作用。
(A-R)用二甲雙胍(2mM)處理小鼠關節軟骨細胞,然後與腫瘤壞死因子-α(TNF-α;100 ng/ml)及白細胞介素-1β(IL-1β；10 ng/ml)共同孵育6h。實時聚合酶鏈反應(PCR)檢測Mmp3、Mmp13、Adamts4、Adamts5 、Col2a1、aggrecan、Sox9和IGF-1 mRNA的表達(n=3)。(I)免疫組織化學(IHC)檢測來自假手術及二甲雙胍治療的內側半月板失穩(DMM)手術小鼠的組織切片。檢測MMP13、Adamts5和Col-X的表達(n=3)。
以上實驗結果提示：二甲雙胍顯著抑制野生型小鼠原代關節軟骨細胞中TNF-α和IL-1β誘導的分解代謝基因MMP13 、MMP3 、Adamts4 、 Adamts5表達，對AMPKα1-/-小鼠關節軟骨細胞中TNF-α和IL-1β誘導的軟骨分解代謝基因表達無明顯影響。二甲雙胍還逆轉了腫瘤壞死因子-α對COL2a1、aggrecan、Sox9、IGF1和Bmp7表達的抑制作用。對AMPKα1-/-小鼠關節軟骨細胞中以上合成代謝基因沒有顯著影響。這些結果表明二甲雙胍不僅通過抑制分解代謝基因發揮其軟骨保護作用，而且還通過AMPK依賴上調合成代謝基因發揮作用。
Figure 4. 二甲雙胍對AMPKα1 KO小鼠DMM骨關節炎模型沒有保護作用。
對10周齡的AMPKα1 KO小鼠進行DMM手術或假手術。於DMM手術前2周及術後2周分別給予二甲雙胍(飲水4 mg/kg/d，直至處死動物)。(A)小鼠膝關節骨性關節炎組織學圖像顯示，二甲雙胍對AMPKα1 KO小鼠OA的發生無明顯影響。黃色箭頭表示關節軟骨退化；綠色箭頭表示骨贅；紅色箭頭表示滑膜增生。(B-K)定量或半定量評估，包括國際骨性關節炎研究會(OARSI)評分(B，G)、軟骨面積(C，H)、滑膜炎評分(D，I)、骨贅大小(E，J)和骨贅成熟度(F，K)。斷層掃描(μCT)分析二甲雙胍治療後6周和12周小鼠(l，M)骨贅的形成情況。測量鈣化的半月板和滑膜組織的體積(n=6)。
Figure 5. 二甲雙胍可減輕骨關節炎(OA)疼痛。
在內側半月板失穩(DMM)手術前2周及術後2周分別給予二甲雙胍(4 mg/kg/d飲水，直至處死動物)。(A、D)DMM術後每兩周使用von Frey細絲測量機械敏感性。用實驗動物行為觀察登記和分析系統(LABORAS，Metris，荷蘭)評估DMM術後2、6和10周自發活動的變化，包括行走距離(E、H)、平均步行速度(I、L)、飼養頻率(M、P)和飼養持續時間(Q、T)(n=4)。
實驗結果提示：二甲雙胍可以顯著提高WT小鼠的縮爪反應閾值，而在逆轉AMPKα1-/-小鼠的縮爪反應閾值和降低疼痛敏感性方面沒有顯著作用。另外使用二甲雙胍治療可以顯著逆轉DMM手術引起的自發活動減少，二甲雙胍治療對AMPKα1-/-小鼠由DMM術引起的自發活動減少同樣沒有顯著影響。
Figure 6. 二甲雙胍上調背根神經節(DRG)AMP活化蛋白激酶(AMPK)的表達。
分別於內側半月板失穩術後6周和12周取小鼠背根神經節組織切片，免疫螢光(IF)染色檢測pAMPKα1和總AMPKα1的表達。(B，C)定量分析結果顯示，DMM手術後AMPKα1表達(磷酸化和總AMPKα1)明顯降低。二甲雙胍顯著增加背根節組織中pAMPKα1和總AMPKα1蛋白的表達(n=3)。進一步分析AMPK下遊的疼痛相關標記物，瞬時受體電位錨蛋白1(TRPA1)的表達，發現TRPA1的表達在DMM手術後6周和12周顯著上調使用二甲雙胍治療可顯著抑制DRG組織中TRPA1的表達(D)。
Figure 7. 二甲雙胍減輕內側半月板部分切除術(PMM)引起的靈長類動物中骨關節炎(OA)的發展。
(A)8.5~11.4歲恆河猴左膝關節行PMM手術，右膝關節行假手術。(B、C)PMM術後7個月觀察恆河猴軟骨損傷情況。結果提示二甲雙胍可以阻止PMM手後關節軟骨的損傷(黃色箭頭：關節軟骨損傷)。(D、E)術後7個月行μCT二維和三維掃描(黃色箭頭為軟骨下硬化，紅色箭頭為骨贅)。結果提示術後7個月軟骨下骨量明顯增加，二甲雙胍治療後軟骨下骨量顯著減少。(F)術前1個月、術後1、3、7個月行核磁共振成像(MRI)監測膝關節OA(紅色箭頭：骨贅；黃色箭頭：軟骨下硬化症；藍色箭頭：膝關節內側副韌帶)。(G)MRI測量股骨內側髁部(MFC)和脛骨內側平臺(MTP)的內側關節軟骨厚度。結果顯示術後3個月和7個月觀察到二甲雙胍治療組的軟骨厚度增加與對照組相比。對照組恆河猴PMM手術+溶劑治療(n=4)，實驗組：恆河猴PMM手術+二甲雙胍治療(n=5)。(H)觀察並記錄動物行為的變化。結果顯示，應用二甲雙胍治療後PMM術後7個月，站立和行走時間明顯延長
以上研究結果表明：二甲雙胍在阻止OA的發生發展同時，還可以緩解小鼠OA相關的疼痛敏感性，其對軟骨保護作用主要是是通過激活AMPK信號，同時二甲雙胍對靈長類動物關節軟骨具有保護作用，提示二甲雙胍可在臨床用於治療OA患者。
本研究存在一定的局限性：本研究表明在關節損傷後不久使用二甲雙胍可以以阻止OA的發生和發展，當OA完全進展時(例如，DMM手術後8周和12周)，二甲雙胍是否能夠延緩OA的進展還不清楚。第二，雖然二甲雙胍在靈長類動物治療OA的研究中取得了良好的效果，但是本研究中使用動物數量相對較少，因此二甲雙胍對大型動物的作用有待進一步研究。第三，本研究中使用年輕、健康的雄性小鼠和雄性恆河猴進行OA研究，二甲雙胍對雌性小鼠、衰老相關的OA模型和肥胖小鼠的作用還未知。