瑞士洛桑聯邦理工學院Matthias P. Lutolf課題組近期在Nature Materials發表「Recapitulating macro-scale tissue self-organization through organoidbioprinting」（該組剛發了一篇腸道類器官構建的Nature）。介紹了一種新型類器官列印技術方法，該方法結合了類器官製造技術和生物3D列印技術的優勢，並成功構建了高度仿生的釐米尺度的組織，包括管狀結構，分支血管和管狀小腸上皮體內樣隱窩和絨毛域等，為藥物發現和再生醫學研究提供了新的技術手段。
類器官和生物3D列印
類器官構建技術的優勢和局限（organoid）：在體內，組織形成嚴重依賴於嚴格調節的形態發生程序，允許細胞群在局部相互作用並自我組織。這些局部之間的迭代交互發育中的組織單位指導細胞分化和模式形成的連續周期，從而建立了大規模生物學上的複雜性。由於其獨特的自組織潛力，幹細胞衍生的類器官是有希望構建出工程方法無法比擬的組織結構和細胞類型組成的局部特徵。但是，由於類器官難以生長到毫米級以上，因此它們缺乏體內器官的大尺寸結構特徵，難以實現更高級別的器官功能響應，限制了類器官技術在體外仿生模型和再生醫學領域的發展。
生物3D列印技術的優勢和局限（bioprinting）
生物3D列印技術可以實現細胞和生物材料的精準空間排列，易於快速構建大尺寸（釐米級）含細胞外基質的仿生組織結構。雖然現在有了越來越多種的細胞列印技術，但其一直存在兩個限制，1）超高濃度細胞三維列印，2）工程排列的細胞缺乏細胞分化和自組織的特徵等。
生物3D列印技術是先進位造技術的一種，並不是和類器官構建相排斥的技術，因此，將類器官製造技術和生物3D列印技術的優勢相結合，有望構建出釐米級在高度仿生的微組織。
BATE列印技術
研究者創新性的提出了BATE列印技術（termed bioprinting-assisted tissue emergence)，使用幹細胞和類器官作為自發的自組織構建單元，這些構建單元可以在空間上排列以形成相互連接且不斷進化的細胞結構。
令人嘆服的是研究者逆天的動手能力
將一個微擠出系統和顯微鏡（自帶三維運動臺）相結合，構建了一個自帶顯微圖像實時觀察的列印系統，並腦洞打開的提出了未來可基於自動顯微鏡實現時空結合的生物3D列印，即列印第一種組織，並培養發育出一定的功能和形態後，再基於顯微成像，放回印表機在第一種組織周邊列印第二種組織，在空間和時間上都精準控制組織的發育。
圖1. 顯微鏡生物3D印表機
BATE顯微列印技術
含有超高密度細胞的高活性生物墨水
研究者採用了類器官構建技術常用且生物活性非常好的膠原和Matrigel作為墨水材料，這些材料來源於天然組織，生物活性好，強度低，不會阻礙幹細胞後續的自組織發育。通過優化墨水參數和列印參數，BATE技術可實現超高細胞密度墨水的列印(每毫升10^8 個細胞)，並保持良好的細胞活性。
BATE方法在人類組織原代細胞大規模類器官或自組織構建方面具有廣泛適用性，研究人員列印了三種具有已知自組織（或自組裝）潛能的細胞類型（hISC，hMSC和HUVEC），並通過培養控制細胞自組織的特定局部相互作用可以形成特定結構的上皮管、結締組織和血管網絡，符合這些細胞原本的組織特徵。
圖2. 不同細胞的列印和自組織發展
類腸道組織的構建
在宏觀尺度上重建複雜的圖案化組織，這需要對幾何學，細胞間相互作用，ECM組成和動力學以及關鍵可溶性因子的存在進行精確控制（圖3a）。小鼠腸道幹細胞（mISC）在Matrigel中培養並添加確定的生長因子混合物（EGF，Noggin和R-spondin（ENR））時，會形成帶有隱窩和類絨毛狀隔室的類器官，類似於該動物的體內小腸上皮。研究者基於此，3D列印了mISC的密集線，並用以模擬宏觀的腸道，通過後續的培養和細胞的自組織發育，該列印的結構展現出高度仿生的腸道組織特徵。這些數據表明，BATE可以在釐米尺度上可靠地複製複雜的組織結構和圖案，並產生高度生理性和工程組織相關性，類似於體內組織的表型和功能。
圖3. 宏觀腸道列印
圖4. 宏觀腸道功能表徵
腸道的分泌響應
多細胞複雜組織列印
BATE同樣可以實現多細胞的列印，研究者嘗試了ISC和IMC的列印和共培養，並展現出具有顯著時空排列的多組織特徵，滿足類器官培養中多種組織或器官整合的需求。
圖5. 共培養列印
總結
與現有的生物列印技術相比，BATE可在不同規模上指導組織形態發生，為複雜的自組織過程提供必要的環境，可以將幹細胞之類的易碎細胞直接列印在Matrigel中，並自組織成複雜的幾何形狀。BATE還可以減少列印時間和幾何複雜性。因此，將類器官製造技術和生物3D列印技術相結合的BATE技術，可以構建高度仿生的釐米尺度的組織，未來可為幹細胞和再生醫學提供新的方法，為工程化自組織（Self-organization）功能化組織甚至多種組織組合提供了強大的工具。
參考文獻
Brassard, J.A., Nikolaev, M., Hübscher, T. et al. Recapitulating macro-scale tissue self-organization through organoid bioprinting. Nat. Mater. (2020). https://doi.org/10.1038/s41563-020-00803-5