循環腫瘤細胞(CTC)分離技術概述

腫瘤就像一個無處不在的惡魔，它善於隱蔽，精於偽裝，長於狡詐，在與人類的PK中往往佔得上風。然而，腫瘤從一個或者幾個「首惡」發展成為有破壞性的「組織」，還是或多或少留下了一些蛛絲馬跡。

早在1869年，澳大利亞學者Ashworth在一例轉移性腫瘤患者血液中首次觀察到從實體腫瘤中脫離並進入血液循環的腫瘤細胞，並首次提出了循環腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTC ）的概念。1976年，Nowell將CTC的定義修正為：來源於原發腫瘤或轉移腫瘤，獲得脫離基底膜的能力併入侵通過組織基質進入血管的腫瘤細胞。上世紀90年代，科學家開始意識到CTC的重要性並對其臨床意義進行研究。2000年以後，CTC日益成為臨床上液態活檢標誌物的研究熱點，並在臨床越來越廣泛的應用。

常規富集手段

CTC在外周血中的含量極少，每10ml血液中可能只含有1個或者幾個CTC，但是同時有1億個白細胞和500億個紅細胞。所以，要對CTC進行分析，第一步必須先進行分離。目前常用的富集方法主要有兩大類，物理學法和免疫學法/免疫化學法。前者是根據CTC的細胞大小和密度與血液中其它細胞不同；後者是利用CTC表面的分子標記物來將其進行區分。

1、密度梯度離心法

血液中各種細胞的密度不同，離心後在細胞分離液中會呈現梯度分布。利用此原理，將患者血液標本加入特定的細胞分離液後進行離心，即可分離出目標細胞。如果將全血在細胞分離液Ficoll中進行密度梯度離心後，從下到上組分依次分布：紅細胞、中性粒細胞、單個核細胞（淋巴細胞、單核細胞、上皮細胞、腫瘤細胞），最上層是血漿。

由於腫瘤細胞會移入上層的血漿中，所以後來出現了改進的技術-OncoQuick（德國Greiner公司）。OncoQuick用一種專用的50 mL試管，內置多孔屏障，其下為密度梯度分離液，使用時將標本置於屏障之上，從而避免在離心之前與分離液混合而汙染。OncoQuick分離法與傳統的Ficoll分離法相比，前者對腫瘤細胞的平均回收率更高，富集效果更好。但是，即便經過改進，這種依靠密度梯度分離CTC的方法的局限性依然顯而易見，比如CTC組分中會因為摻雜其它細胞導致產物不純。同時也恰恰因為互相摻雜，導致一部分CTC被捨棄，使得本就很稀少的CTC甚至檢測不到，影響其靈敏度。

圖1：Oncoquick分離全血示意圖。

2、過濾法

2000年，Vona等報導了一種依據細胞大小，通過過濾直接富集上皮性腫瘤細胞的方法（isolation by size of epithelial tumor cells, ISET）。該方法使用８μｍ孔徑的聚碳酸酯（polycarbonate）膜來過濾血液，較小的淋巴細胞和中性粒細胞可以通過，而較大的腫瘤細胞則被阻滯在膜上。該方法的顯著優點是操作非常簡單，可以避免多步驟分離造成的稀少細胞的破壞和丟失。另外，通過該方法分離的CTC形態和結構保持完好，有利於後續分析。重複性實驗顯示，ISET可從1ml血中將摻入的１個腫瘤細胞分離出來。其局限性在於一些較大的白細胞容易與腫瘤細胞混在一起，而一些較小的CTC也容易被濾過而丟失，因此這種方法靈敏度和特異性都存在問題。

圖2：ISET法分離CTC以及後續研究

3、免疫磁珠法

由強生公司子公司Veridex研發的CellSearch系統是全球第一個經過FDA（2004年獲批）和CFDA（2012年獲批）批准用於檢測CTC的商業化產品。該系統號稱只需7.5 ml血液樣本，即可從400多億的血細胞中檢測到一個CTC，敏感性很高。其原理是上皮細胞來源的腫瘤細胞表面上皮細胞粘附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）呈陽性，而血液細胞則不表達EpCAM，依據此特點，將EpCAM抗體包被於磁珠表面，便可將CTC分離出來。CellSearch系統的基本流程是：先使用EpCAM抗體磁珠對上皮細胞進行富集，然後將細胞固定，用DAPI螢光核染料、CD45螢光抗體和CK8、CK18以及CK19螢光抗體標記細胞，再用半自動四色螢光顯微鏡Cell Spotter Analyzer進行分析。因為紅細胞無核，故不能被DAPI染色；而上皮來源的CTC因為不表達CD45（白細胞共同抗原），白細胞則不表達CK，所以基於以上的交叉檢驗，挑選出CK陽性、CD45陰性的上皮細胞，此即為CTC。

圖3：CellSearch分離檢測CTC。

CellSearch系統已被美國FDA批准應用於臨床，目前主要應用於預測轉移性乳腺癌、結直腸癌或前列腺癌的無病生存期（Disease-free survival，DFS）和總生存期（Overall survival，OS）。臨床應用結果表明，通過CellSearch系統檢測CTC是傳統醫學影像學、血清學的有益補充，可以判斷當前腫瘤治療方案的有效性，提供用藥指導，並有效評估患者的預後。該方法簡便、易行，而且可以對同一患者進行連續監測。CellSearch後續也被逐步發展試用於檢測其他腫瘤患者的CTC。由於某種原因，2016年初強生停止銷售該產品。

4、CTC晶片

2007年，美國麻省總醫院癌症中心與強生公司合作，研發出一種能檢測出極微量CTC的微流體矽晶片，稱為CTC-Chip。該晶片的表層密布了近8萬個包被EpCAM抗體的微位點，當血液樣本流過晶片時，該抗體可與腫瘤細胞表面EpCAM相結合從而粘附腫瘤細胞。這種方法能在10億個以上的血細胞中檢出單個癌細胞，但尚未用於臨床。

2010年，該機構成功升級CTC-Chip，稱為HB-Chip（herringbone-chip）。與第一代CTC-Chip相比，HB-Chip具有以下優點：（1）晶片的表面形狀從光滑改進為人字形交叉溝槽狀，這樣在血液樣本流過晶片時會形成微漩渦，增加了與晶片表面所粘附抗體互相接觸的機會，可更有效地捕獲數量極少的循環腫瘤細胞。研究表明，HB-Chip可捕獲血液樣本中90%以上癌細胞，較CTC-Chip的分離效率提高25%。（2）HB-Chip能捕捉到CTC-Chip或其他CTC分離設備從沒有發現過的循環腫瘤餵栓子（circulating tumor microemboli，CTM）。對CTM的深入研究可能會進一步揭示腫瘤的轉移特性。（3）該晶片配備了一個標準的載玻片，可以使用傳統的病理檢查方法來鑑別癌細胞。（4）更容易操作，而且可以處理更大容量的血液樣本，因而能用於較大規模的臨床研究。

圖4 HB-chip捕獲CTC

升級技術

隨著流式細胞技術、微流控技術、納米技術的發展，CTC的分離技術逐漸出現融合的趨勢，大大提升了CTC分離的靈敏度和特異性。

ISET聯合雷射掃描細胞計量儀（laser scanning cytometry，LSC）是近年來應用於CTC檢測領域的一項新技術。該技術先利用ISET原理將腫瘤細胞從外周血細胞中分離出來，然後應用LSC對已經標記螢光抗體的細胞進行掃描識別，從而可以準確檢測到外周血中所含有的極微量腫瘤細胞。該方法與Cellsearch檢測系統相比，ISET不依賴於相關抗原-抗體反應而直接過濾外周血進行腫瘤細胞富集，操作簡單方便，減小了腫瘤細胞的丟失；而且這種物理分離法不會破壞腫瘤細胞的形態學特徵。所以，ISET能從少量外周血中篩選出腫瘤細胞，並為下一步的形態學、細胞學以及分子生物學研究提供條件。後續的LSC可對所檢測到的陽性細胞進行進一步目測確認，提升了CTC檢測的準確性。

2013年，麻省總醫院的團隊在第一代CTC-chip和第二代HB-chip的基礎上，開發出了第三代技術，稱為iChip（inertial focusing-chip）。該技術通過流體作用力將細胞排成一列縱隊，晶片利用流體力學分選，去除最小的血液成分。然後，它利用正向選擇來去除淋巴細胞，保留剩下的一切。iChip比人字形晶片要快得多，每小時能處理20 ml血液。它還能產生未標記的細胞，便於培養和分析。該技術實際上整合了物理分離法和免疫分離法，對CTC的分離效果大大提升。

曙光初現，任重道遠

然而，我們不難看出，上述技術存在諸多問題。比如，並非所有腫瘤都來源於上皮細胞，甚至上皮來源的腫瘤也可能逐漸喪失上皮標記物，我們從CellSearch系統的應用局限就可以看出。而且，機體的炎症反應也會導致血液中存在上皮細胞。另外，CTC的出現和病理進程有關，時間窗口的選擇可能決定了檢測的準確性。即使存在諸多困難，我們應該看到，CTC作為一種具有高度可行性和可重複性的非侵入性新型癌症監測技術，它能夠真正全病程參與腫瘤的檢測、用藥指導、預後評估等，這必將極大的推動腫瘤的精準治療。

註：本文來自五洲東方，未經許可不得轉載