文章標題：
Unexpected patterns of Epstein–Barr virus transcription revealed by a High throughput PCR array for absolute quantification of viral mRNA
Rosemary J Tierney， Claire D Shannon-Lowe， Leah Fitzsimmons， Andrew I Bell，Martin Rowe
雜誌：Virology
DOI：doi.org/10.1016/j.virol.2014.10.030
研究背景：
通過RT-QPCR晶片平臺的絕對定量檢測不同潛伏期和溶解感染狀態的Epstein-Barr病毒轉錄本，並獲得新發現。
方法
對培養的細胞進行誘導和轉染Epstein-Barr病毒，通過PCR晶片絕對定量方法，檢驗不同時間點的mRNA變化。
結果
1利用48:48Fluidigm晶片RT-QPCR驗證EBV轉錄本
從10個獨立實驗獲得的相同6個代表性基因的Ct值的比較證明，Fluidigm Biomark HD系統的結果在4至5個對數範圍內是可重複的（圖1D）。
圖1.（A）AQ質粒的設計。（B）熱圖總結了10倍稀釋的AQ質粒與對照質粒的45個PCR測定的信號。（C）5份EBV轉錄本和PGK細胞轉錄本的典型標準曲線，包括潛伏轉錄本Wp；立即早期（IE）裂解轉錄本，BZLF1；早期（E）裂解轉錄本，BALF1；晚期（L）裂解轉錄本，BILF1；非編碼轉錄本，EBER1；和細胞轉錄本，PGK1。（D）10個獨立預擴增的AQ-質粒稀釋液獨立重複的結果證明，Fluidigm Biomark HD系統的結果在4至5個對數範圍內是可重複的
2誘導裂解周期後EBV轉錄本的絕對定量
在使用質粒對照驗證了高通量絕對定量方法之後，接下來使用EBV分析組來表徵從潛伏期轉變為病毒複製後的EBV轉錄組。細胞誘導裂解循環，並且在0.5至72小時的間隔收穫細胞用於RT-QPCR分析。
未經處理的Akata-BL細胞（0小時）的潛在基因轉錄水平非常低。誘導後2小時，BZLF轉錄本的數量明顯增加，儘管第二個IE RNA BRLF1的水平低得多並且在整個時間過程中保持如此。BZLF1是誘導後4小時最豐富的轉錄本。在此時間點也檢測到幾種E RNA，其中BHRF1，BMLF1，BMRF1，BNLF2A和BNLF2B是最豐富的。除BNLF2A和BNLF2B外，E基因表達通常持續升高至誘導後12小時，然後下降。相比之下，L基因表達通常在誘導後24小時達到峰值。雖然LF1和LF2的水平在誘導後12小時達到峰值，與E基因表達一致，但LF3僅在24小時達到最大水平。
誘導後24小時潛伏基因轉錄增加也很明顯，最明顯的是LMP1，EBNA2和LMP2A（圖2，圖3）。最豐富的這些LMP1仍然比最豐富的裂解轉錄本BVRF2低約30倍。由於裂解循環Fp啟動子的激活，EBNA1轉錄本在裂解循環誘導後也增加（圖3）。編碼EBNA1的UK-和FUK-剪接的轉錄本的水平仍然非常低，並且僅代表總Fp-起始轉錄的約10％（FU測定，圖3）。
圖2.在裂解周期誘導期間EBV轉錄本的絕對定量。個體潛伏，即刻早期（IE），早期（E），晚期（L）和非編碼轉錄本的水平。
圖3.裂解周期誘導期間EBV轉錄變化的動力學研究。
3原發性B細胞感染期間EBV轉錄本的絕對定量
接下來更全面地表徵和量化EBV驅動的體外原代靜息B細胞轉化過程中潛伏和裂解病毒轉錄本的絕對水平。分離CD19陽性B細胞並用MOI為100的2089重組EBV毒株感染，並在多個時間點收穫細胞以分離RNA和定量病毒基因轉錄本。
感染後第1天，Wp啟動的和EBNA2特異性轉錄本的水平已經超過60,000轉錄本/ ng RNA（圖4A），其中還存在較低水平的Y2-HF剪接的潛在BHRF1轉錄本。這些Wp啟動的EBNA2和BHRF1轉錄本的初始水平分別比感染後3個月內測試的3個早期傳代LCL中的平均水平高約18倍和3倍（圖4A和B）。Cp啟動的EBNA轉錄本與UK-剪接的EBNA1和EBNA3A轉錄本一起在感染後第1天也可檢測到，但是水平低得多（圖4A）。
到感染後第2天，Wp活性和EBNA2轉錄水平開始下降，而Cp啟動的轉錄物增加，LMP1現在可檢測到。在剩餘的時間過程中，Wp活性和EBNA2和BHRF1轉錄水平繼續下降，而Cp啟動的轉錄物保持不變。到第5天，LMP1水平達到最大值，EBER1 RNA變得可檢測到。感染後10天，除EBER外，轉錄譜與已建立的LCL相似（圖4A和B）。即使在Wp活性在稍後的時間點下降後，Wp啟動的轉錄物的數量仍然與Cp轉錄物的數量相當。
與潛在基因轉錄相反，在初次感染期間存在非常少的裂解周期轉錄物（圖4A，5）。值得注意的例外是BNLF2A和BNLF2B，其與LMP1同時檢測到，並且與LMP1等同（圖4A和5）。在其他可檢測的裂解周期轉錄物中，最豐富的是BZLF1，其在感染後5天達到峰值（圖4A）。然而，該BZLF1信號至少比真正裂解循環期間觀察到的水平低100倍（參見圖2和4A），這意味著小於0.5％的細胞表達高水平的BZLF1或BZLF1在整個表達水平均很低。
圖4.在正常B細胞感染期間誘導的EBV轉錄本的絕對定量。（A）從外周血分離的原代B細胞在M.O.I.感染。（B）平行測定3個新建立的LCL（感染後2-3個月）。
圖5.熱圖比較裂解周期誘導期間和原代B細胞感染期間的EBV轉錄本水平。數據表示為相對於PGK轉錄本的EBV轉錄本的數目。
4感染性病毒體內的EBV mRNA
通過密度梯度離心純化的病毒製劑中存在的RNA轉錄物和EBV DNA基因組的數量（表1）。研究結果表明，傳入的病毒可以提供無關緊要的病毒轉錄本。
表1.在成熟感染性病毒體中檢測到EBV mRNA
5不同形式潛伏期的EBV病毒轉錄本定量
接下來，我們比較了8個Lat I BL系列，5個Wp限制BL系列，5個Lat III BL系列和10個Lat III LCL系列中EBV轉錄本的絕對水平。
圖6.(A)從3條顯示不同形式潛伏期的具有代表性的BL線和從Oku BL分離出的EBV株感染正常B細胞所建立的LCL中獲得晶片數據。(B)從8個Lat I BL線，5個Wp BL線，5個Lat III BL線和10個LCL獲得的數據的熱圖。
6 BL活組織檢查樣本中EBV轉錄本的定量
圖7.（A）從5個BL活組織檢查樣品中獲得的晶片數據。（B）從所有7個BL活組織檢查獲得的晶片數據的熱圖匯總。
結果總結
首先，在感染正常B細胞期間，Wp啟動的潛在基因轉錄物在Cp啟動子激活後比目前所懷疑的更加豐富。其次，EBNA1轉錄水平在所有形式的潛伏期中都非常低，通常為每個細胞1到10個轉錄物。EBNA3A，-3B和-3C轉錄物在潛伏期III中同樣非常低，通常在與EBNA1轉錄物相似或更低的水平。第三，裂解基因轉錄物的子集在Burkitt淋巴瘤細胞系中可檢測到低水平，包括：具有致癌特性的BILF1，以及表徵不佳的LF1，LF2和LF3基因。對7個非洲BL活組織檢查的分析證實了該轉錄譜，但另外揭示了LMP2轉錄物的顯著表達。