斬獲諾獎,再掀熱潮 基因編輯到底是什麼?

北京時間10月7日，瑞典皇家科學院在斯德哥爾摩宣布，將2020年度諾貝爾化學獎授予科學家伊曼紐爾·夏彭蒂埃(Emmanuelle Charpentier)和珍妮弗·A·杜德娜(Jennifer A. Doudna)，獎勵她們在基因組編輯方法上的突破。

諾貝爾獎委員會在官方新聞稿中稱：「自2012年夏彭蒂埃和杜德娜發現CRISPR/Cas9基因「魔剪」以來，它們的使用量激增......將生命科學帶入了一個新時代，並在許多方面為人類帶來了最大利益。」

基因編輯(Genome Editing)，又稱基因組工程，是遺傳工程的一種，是指在活體基因組中進行DNA插入、刪除、修改或替換的一項技術。其與早期的遺傳工程技術的不同之處在於，早期的遺傳工程技術是在宿主的基因、基因組中進行隨機插入基因物質，而基因編輯是在特定位置插入基因片段。

為什麼要進行基因編輯

基因可被視作基本遺傳單位，支持著生命的基本構造和性能。儲存著生命的種族、血型、孕育、生長、凋亡等過程的全部信息。生物體的生、長、衰、病、老、死等一切生命現象都與基因有關。它也是決定生命健康的內在因素。因此，基因具有雙重屬性：物質性(存在方式)和信息性(根本屬性)。

可以說，基因決定性狀表現，雙眼皮，大眼睛都是由基因決定的（整容除外）。除了外在的特徵表現，基因更大的決定性作用體現在內部。由於基因的數量眾多，攜帶的信息也是海量，在複製過程中可能或出現錯誤，造成基因缺陷，這種缺陷還具有遺傳性。

1987年諾貝爾諾貝爾生理學或醫學獎得主利根川進曾表示，除了外傷，一切疾病都與基因有關。遺傳基因缺陷也是引發疾病的三大根本原因之一。

例如，美國演員安吉麗娜·朱莉家族遺傳了突變的BRCA1基因。BRCA1本是具有抑制惡性腫瘤發生作用的基因，其通過編碼產生腫瘤抑制蛋白。如果發生突變，其蛋白產物不進行或不能正常行使功能，DNA損傷可能得不到適當的修復，從而使細胞可能形成其他遺傳信息的改變，導致癌症。

正是由於這一基因作祟，朱莉家族中的女性多患乳腺癌和卵巢癌，根據基因檢測，她本人患乳腺癌和卵巢癌的機率也高達87%和50%。為了防範患癌風險，她最終選擇切除雙側乳腺。

除了癌症外，常見的遺傳性疾病還有地中海貧血、先天性肌強直、血友病、白化病、視網膜母細胞瘤以及家族性結腸息肉病等。

遺傳疾病由於有基因造成，所以幾乎不可能治癒，患者需要終身用藥以緩解病症，不止承受巨大的身體和心理壓力，經濟壓力也同樣令人難以承受。

有沒有一勞永逸的辦法呢?

基因編輯，人類走出了三條路

用藥講究對症下藥，遺傳疾病的根源就在於基因缺陷，因此，要一勞永逸的解決遺傳疾病，可以利用基因編輯。

人類目前已經開發出了三種編輯手段，分別是鋅指核酸酶(Zinc Finger Nucleases, ZFN)，轉錄激活樣效應因子核酸酶(Transcription Activator-like Effect Nucleases,TALEN)和成簇規律間隔短回文重複(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats,CRISPR/Cas9)系統。

要進行基因編輯，首先就需要將產生變異的基因「切割」，在基因這樣微觀的級別上進行切除，對工具的要求就很高。

「切割」的實質就是在基因組內特定位點創建DNA雙鏈斷裂(Double-Strand Breakage,DSB)，也就是在DNA雙螺旋結構中兩條主鏈的同一對應處或緊密相鄰處同時斷裂。

DNA雙螺旋結構示意圖

在研究中，人們發現核酸酶在「切割」方面表現不錯。那麼這種酶是如何實現切割的呢?

從上圖我們可以看出，DNA雙螺旋結構包含兩個部分，即兩個長鏈和與其垂直的數個「短槓」。其中，兩個長鏈被稱為主鏈(backbone)，「短槓」實則為鹼基對(basepair,bp)。主鏈直徑2nm，主鏈間距3.4nm，一個螺旋周期包含10對鹼基，相鄰鹼基間距0.34nm。

切割是在主鏈上進行的，兩個切割點應當處於相對應的位置。主鏈由脫氧核糖和磷酸基通過酯鍵交替連接而成，而核酸酶剛好可以將這種鍵結切斷，進而在兩條主鏈上各產生一個切口，且不破壞鹼基對。

由於切割需要在特定的基因片段上進行，因此首先就需要識別出特定片段。遺憾的是，核酸酶通常在多個位點進行識別和切割，特異性較差。

為了解決識別問題，科學家對一些核酸酶進行了改造，這就包括上面提到的ZFN,TALEN和CRISPR/Cas9。

第一代基因編輯手段採用的就是ZFNs，這種酶由兩個功能結構域組成：DNA結合結構域和DNA切割結構域。

一個DNA結合結構域包含一個雙指模塊鏈，每個模塊識別一個獨特的六聚體(即6個鹼基對)DNA序列。這一結構域就充當定位器的作用，用於識別特定片段。當其與DNA切割結構域融合在一起時，就形成了具有高度特異性的「基因組剪刀」。

主鏈斷裂後，細胞自帶的兩種修復機制——同源重組修復（HDR）和非同源末端連接修復機制（NHEJ）被激活，基因開始自我修復。

ZFNs雖然相對於常規核酸酶特異性有所提高，但還是不夠。易產生非特異切割，即脫靶切割。脫靶可能導致過度雙鏈斷裂，使修復機制不堪重負，還有可能導致DNA隨即整合，產生難以預料的後果。

第二代基因編輯技術採用TALENs。這種酶也由兩個部分組成：激活因子樣效應物(transcription activator-like effector)和DNA切割結構域。前者是一種由植物細菌分泌的天然蛋白，具有識別特異性DNA鹼基對的特性。將其與DNA切割結構域結合後，二者相互作用，就成了基因編輯的「剪刀」。

與上一代相比，其特異性更高，因此脫靶的概率更低，所帶來的後果也就越小。不過，其生產過程較為繁瑣，過程需要用到液體操作機器人(liquid-handling robot)。

第三代使用的是CRISPR/Cas9技術，近些年的關注度非常高。今年的諾貝爾獎頒給這一領域的科學家也說明了科學界對其的認可。

CRISPR/Cas系統本身並不是為了基因編輯而生，它是一種存在於多數細菌與絕大多數的古菌中的一種後天免疫系統。

1987年，日本科學家在大腸桿菌的基因體發現一段古怪的規律序列，某一小段 DNA居然一直重複出現，而重複片段又被相同的間隔隔開，用途不明。後來，人們又在其他細菌中也發現了這一特徵。

CRISPR為人所熟知得益於西班牙微生物學家弗朗西斯科·莫伊卡(Francisco Mojica)的一篇論文，他在論文中指出，這是一種廣泛存在的免疫機制，用於防範病毒入侵。

病毒入侵時，會將自身的DNA注入到細胞當中，以便進行繁殖(癌細胞通常就採取這種做法)。不過，檢測到病毒入侵後，免疫系統激活，開始識別和殺死病毒。病毒清除完成後，有的細胞會將病毒的DNA碎片以間隔(下圖右部彩色部分)的形式注入到自己的基因中。

CRISPR位點完整結構圖(圖源：http://blog.sciencenet.cn/blog-3160644-983657.html)

總的來說，這一系統相當於一個「黑名單」，對所有入侵的病毒進行DNA建檔，在其下次入侵時可以快速識別並殺死。

上圖中的前導區(leader)被認為是CRISPR序列的啟動器。左側基因編碼的蛋白均可與CRISPR序列區域共同發生作用，如Cas1 和Cas2就是用於掃描並切割病毒的DNA片段。

目前已發現了三種不同類型的 CRISPR/Cas系統，存在於大約40%和90%已定序的細菌和古菌中。CRISPR/Cas9系統就屬於第二種，是目前最成熟也是應用最廣的類型。

用於基因編輯的CRISPR/Cas系統由Cas9核酸酶與嚮導RNA(small guide RNA)構成。後者指導Cas9識別特定基因靶位，切割DNA造成雙鏈DNA斷裂，並啟動DNA損傷修復機制。

具體流程如下圖：

CRISPR/Cas9基因編輯示意圖 (圖源：http://blog.sciencenet.cn/blog-3160644-983657.html)

使用該技術進行基因編輯時，在基因的上下遊各設計一條嚮導RNA(嚮導RNA1，嚮導RNA2)，將其與含有Cas9蛋白編碼基因的質粒一同轉入細胞中。嚮導RNA通過鹼基互補配對可以定位特定基因靶位，Cas9蛋白會使該基因上下遊的DNA雙鏈斷裂(原理和上述ZFN一致)。

DNA雙鏈斷裂後，生物體自身存在著的DNA損傷修復機制開始工作，會將斷裂上下遊兩端的序列連接起來，從而實現了細胞中目標基因的敲除。

當然，要實現基因替換，需要在上述基礎上為細胞引入供體DNA分子，這樣細胞就會按照提供的模板在修復過程中引入片段插入或定點突變。這樣就可以實現基因的替換或者突變。

相對於前兩代技術，CRISPR/Cas9基因編輯技術操作簡單，成本低廉，但它還是沒有徹底解決脫靶問題。

應用方面，除了基因敲除，基因替換等基礎編輯方式，還可以被用於基因激活，疾病模型構建，甚至是基因治療。

目前，科學家在實驗室已完成了對斑馬魚、老鼠和人類細胞的編輯。2017年，美國國家眼科研究所研究人員吳志健(音譯)及同事利用這一技術成功阻止了實驗鼠視網膜退化並改善了視覺。該研究證明了利用該技術治療疾病的可行性。

不過，這一技術目前還無法運用到人體，這其中既有技術因素，也有倫理問題。例如，此前川大華西醫院的研究團隊利用CRISPR-Cas9基因編輯技術治療肺癌的臨床試驗就需要通過醫院審查委員會的倫理審批。2018年原南方科技大學副教授賀建奎的「基因編輯嬰兒」實驗掀起軒然大波，主導人最終還身陷囹圄。

當然，基因編輯技術的巨大應用前景著實令人憧憬，此次諾貝爾獎也表明這一技術的重大意義，至於其涉及的倫理問題，可以通過監管加以規範。

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