改善稀有密碼子和胺基酸殘基限制提高重組人ADAM15去整合素結構域...

2020-12-05 生物谷

微生物學報Acta Microbiologica Sinica

48(8)：1067~1074; 4 August 2008

基金項目: 國家自然科學基金(30772586)

*通訊作者。Tel/Fax: +86-510-85918219; E-mail: jinjian31@hotmail.com

作者簡介: 吳靜(1981. ), 女, 江蘇大豐人, 博士研究生, 主要從事細胞與分子藥理的研究。E-mail: wujing@jiangnan.edu.cn

吳靜1,2，雷楗勇1，張蓮芬1,2，花慧1，金堅1, 2*

（1 工業生物技術教育部重點實驗室，2 江南大學醫藥學院分子藥理研究室，無錫 214122）

摘要：【目的】為提高重組人ADAM (A Disintegrin And Metalloproteinase) 15 去整合素結構域蛋白(rhADAM15)的表達水平。【方法】在詳盡分析rhADAM15 的cDNA 和GST(穀胱甘肽-S-轉移酶)-ADAM15 結構的基礎上，選擇表達宿主菌並對表達質粒進行改造。【結果】(1)選擇能為大腸桿菌稀有密碼子提供額外tRNA 的Escherichia coli. Rosetta(DE3)作為宿主菌，將質粒pGEX-ADAM15轉化於其中在最佳誘導表達條件下獲得298 mg/L 融合蛋白GST-ADAM15；(2) 採用PCR 體外定點突變技術將目標蛋白編碼區稀有密碼子GGA(Gly425)替換為GGC，使融合蛋白表達水平提高9.4%；(3) 通過消除凝血酶識別序列附近的Pro-Glu-Phe 殘基，提高凝血酶酶切效率，使rhADAM15 產量提高了35.7%；(4)在GGA 替換為GGC 基礎上切除「Pro-Glu-Phe」殘基，使rhADAM15 產量提高到68 mg/L，比分別切除「Pro-Glu-Phe」殘基、GGA 替換為GGC 和野生型提高了19.2%、51.1%和61.9%。【結論】這一結果表明，在充分認識目標蛋白特性的基礎上定向選擇表達宿主並改造表達質粒能實現外源蛋白高水平表達。

關鍵詞：ADAM15 去整合素結構域；大腸桿菌Rosetta (DE3)；稀有密碼子；PCR 定點突變；抑制血管生成

中圖分類號：Q816 文獻標識碼：A 文章編號：0001-6209 (2008) 08-1067-08

Improving production and bioactivity of recombinant human disintegrin domain of ADAM15 (rhADAM15) in Escherichia Coli

Jing Wu1,2, Jianyong Lei1, Lianfen Zhang1,2, Hui Hua1, Jian Jin1,2*

(1Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education,  2Department of Pharmaceutical and Molecular Biotechnology, School of Pharmaceutical and medical, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

Abstract: [Objective] To enhance the production and bioactivity of  recombinant human disintegrin domain of ADAM15 (A Disintegrin and Metalloproteinase 15) (rhADAM15) in Escherichia coli. [Methods] The expression host was chose and the recombinant expression plasmid pGEX-ADAM15 was constructed, based on analysis of the cDNA sequence of rhADAM15. [Results] (1) 298 mg/L GST (Glutathione-S-transferase)-ADAM15 and 42 mg/L rhADAM15 were achieved when choosing E. coli Rosetta (DE3) as the expression host that could supply additional tRNA for rare codons. (2) The GST-ADAM15 expression level increased to 326 mg/L after changing the rare codon GGA (Gly425) to GGC by PCR (Polymerase Chain Reaction)-based site-directed mutagenesis. (3) The rhADAM15 concentration increased to 57 mg/L by deleting the 「Pro-Glu-Phe」 at the GST-ADAM15 junction to improve the thrombin cleavage efficiency. (4) Finally, by combinational introduction of the favorable codons and suitably eliminating of certain amino acid sequence, rhADAM15 concentration reached the highest level (68 mg/L). [Conclusion] The high expression of heterologous protein could be achieved by releasing rare codon usage and amino acids residues restriction.

Keywords: recombinant ADAM15 disintegrin domain; Escherichia coli Rosetta (DE3); rare codons; PCR site-directed mutagenesis; anti-angiogenesis

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