10月6日，國際頂級期刊PNAS（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，美國科學院院報）在線發表了由美國國立衛生研究院（NIH）陳小元、復旦大學姜世勃、謝幼華和陸路共同通訊，美國國立衛生研究院（NIH）Lang Rao、復旦大學夏帥和徐巍共同一作的文章 「Decoy nanoparticles protect against COVID-19 by concurrently adsorbing viruses and inflammatory cytokines」，闡述納米誘餌通過兩步中和作用有效幹預病毒感染及其相關的炎性因子風暴等免疫疾病，為新冠肺炎治療藥物的設計提供了全新的策略。
先說重點：
嚴重急性呼吸系統綜合症冠狀病毒2（SARS-CoV-2）引起的COVID-19大流行到目前仍無有效的疫苗或藥物，這更加凸顯了迫切需要快速開發針對這種新興病毒的治療策略。在這裡，我們通過強大的兩步中和方法設計了針對COVID-19的誘餌納米顆粒：第一步是中和病毒，第二步是中和炎症細胞因子 ─ 白細胞介素6（IL-6）和粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）。通過融合衍生於人髓單核細胞（含有GM-CSF受體的THP-1細胞)的細胞膜納米囊泡和穩定表達血管緊張素轉化酶II（ACE2）受體的基因工程細胞（含有GM-CSF受體的293T細胞）製成納米誘餌。通過與宿主細胞競爭病毒結合，這些納米誘餌可有效保護宿主細胞免受SARS-CoV-2偽病毒和真病毒的感染。此外，依靠納米顆粒表面豐富的細胞因子受體，納米誘餌可有效地結合併中和炎性細胞因子 ─IL-6和GM-CSF並顯著抑制免疫紊亂和急性肺炎小鼠模型中肺臟的損傷。此項工作為持續的COVID-19和未來的潛在流行病提供了一種簡單、安全且強大的抗病毒納米技術。
文章解讀：
1. 納米誘餌的製備：
科研人員首先通過基因工程製備能表達ACE2（新冠病毒的受體）的293T（293T / ACE2）細胞。免疫螢光成像和流式細胞術證實了ACE2能在293T細胞上高效表達。為了提取細胞膜納米囊泡，科研人員通過低滲裂解、機械破壞和梯度離心的組合先去除細胞內內容物。隨後通過一系列超聲處理並通過微型擠出機上的納米孔將細胞膜通過納米孔擠出，製備了293T/ACE2和THP-1的細胞膜衍生的納米囊泡（即ACE2-Ves和THP1-Ves）。之後，將ACE2-Ves和THP1-Ves混合，超聲處理並反覆通過納米孔擠出，以形成納米誘餌。透射電子顯微鏡（TEM）和動態光散射（DLS）表徵表明，納米誘餌是圓形脂質滴，平均大小為100 nm。通過蛋白質印跡分析，研究人員進一步確定了納米誘餌能夠保留負責與病毒和細胞因子結合的關鍵受體蛋白，包括SARS-CoV-2的受體蛋白 ─ ACE2，IL-6的受體蛋白 ─ CD130和GM-CSF的受體蛋白 ─ CD116。此外，酶聯免疫吸附測定（ELISA）定量了ACE2水平，並證明1μg納米誘餌含有約140 pg ACE2。
2. 納米誘餌抑制SARS-CoV-2偽（假）病毒和真病毒（野生型）的感染
確認納米誘餌的製備成功後，科研人員又測試了納米誘餌基於偽病毒（PsV）的抗病毒作用。發現PsV感染被ACE2-Ves和納米誘餌顯著抑制，這表明在納米誘餌表面顯示的高水平ACE2可以劫持S蛋白介導的病毒感染。眾所周知， SARS-CoV和SARS相關的冠狀病毒（SARSr-CoV）也依靠人ACE2受體進入細胞。因此，研究人員進一步測試了基於假型SARS-CoV和SARSr-CoV的納米誘餌的抗病毒能力。研究結果表明，納米誘餌對假型SARS-CoV和SARSr-CoV的抑制作用與假型SARS-CoV-2相似，這表明納米誘餌具有廣譜的廣譜抗病毒能力。野生型的SARS-CoV-2也用於測試納米誘餌的抗病毒能力。為此，在存在納米誘餌的情況下，將猴腎Vero-E6細胞與SARS-CoV-2孵育，並通過免疫螢光評估病毒核蛋白（N蛋白）的表達水平。與PsV感染結果相似，納米誘餌顯示出很強的抗活病毒作用，可明顯降低病毒載量。我們用定量實時聚合酶鏈反應（qRT-PCR）進一步檢查了上清液中的病毒拷貝數，並證明在用納米誘餌治療後，病毒RNA水平以劑量依賴性方式顯著降低。
3. 納米誘餌可在體外中和炎性細胞因子（in vitro）
為了探究病毒感染期細胞因子表達紊亂情況，科研人員進一步研究了納米誘餌結合炎症細胞因子的能力。將含有已知初始濃度的IL-6和GM-CSF的溶液與誘餌納米顆粒一起孵育，去除納米顆粒後，通過ELISA定量上清液中的殘留細胞因子。得益於納米誘餌上豐富的細胞因子受體，研究人員證明了20μg納米誘餌去除了約160 pg IL-6和約25 pg GM-CSF，這表明納米誘餌有望有效地抑制TNF-α引起的細胞因子風暴。COVID-19與肺部感染和損傷密切相關，後者可能觸發炎性細胞因子的產生，導致巨噬細胞/單核細胞募集增強，進而加劇炎性反應。然而，由於缺乏ACE2，THP-1細胞對SARS-CoV-2的滲透性不高。為了模擬感染引起的炎症狀態，科研人員使用脂多糖（LPS）刺激THP-1細胞上調炎症細胞因子。LPS處理後，IL-6和GM-CSF的水平均顯著升高，證實了該模型中激活的炎症反應。然後，科研人員基於此模型測試了納米誘餌的細胞因子中和性能，發現用納米誘餌治療後，IL-6和GM-CSF的蛋白水平顯著降低，表明活化的炎性因子得到有效幹預。
4. 納米誘餌在體內抑制急性肺炎（in vivo）
在確認了納米誘餌在體外的細胞因子中和能力後，科研人員進一步地檢測了納米誘餌的體內有效性。首先，通過鼻道吸入的方式將螢光標記的納米誘餌施用於小鼠，以確定納米誘餌在體內的生物分布。即使在72小時後，單劑量的納米誘餌也顯示出在肺中的出色滯留性，這表明納米誘餌的下遊吸入遞送對於體內細胞因子的中和具有潛在作用。隨後，科研人員在急性肺部炎症（ALI）小鼠模型上測試了納米誘餌的體內性能。為了誘導ALI，科研人員首先使小鼠於氣管內（intratracheally, i.t.）吸入LPS。在BALF中，LPS攻擊後IL-6和GM-CSF水平顯著升高，表明肺部出現嚴重的炎症狀態。隨後的實驗結果顯示，納米誘餌接種組有效地降低了BALF中的IL-6、GM-CSF的總蛋白水平，表明納米誘餌具有很強的廣譜炎性細胞因子的中和作用。此外，在LPS攻擊後24小時，安樂死所有小鼠進行組織學檢查。在LPS攻擊的小鼠的肺部觀察到肺泡壁增生，肺泡腔消失，血管擴張和充血以及肺泡炎性細胞浸潤，證實了在此ALI模型中嚴重的肺損傷現象。而納米誘餌組以劑量依賴的方式顯著抑制或緩解了肺損傷，表明納米誘餌在抑制COVID-19相關的免疫紊亂和肺損傷中具有潛在的治療或緩解作用。
總結：
不難發現，此研究為防控新冠肺炎感染提出了新型的藥物設計思路，在幹預病毒感染的同時，中和驗證細胞因子，進一步緩解由細胞因子風暴引起的免疫紊亂。同時，此納米誘餌顆粒具有較廣譜的冠狀病毒中和作用，可抗擊於多種使用ACE2作為入侵受體的冠狀病毒，且無生物毒性，為新型抗新冠病毒藥物的設計提供了獨特的解決方案。
參考文獻：
https://www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.2014352117/-/DCSupplemental.