NIH陳小元JACS:過氧化銅納米點實現過氧化氫自給型化學動力學治療

共同第一作者：林立森，黃濤；通訊作者：陳小元，王生；

通訊單位：美國國立衛生研究院；

論文DOI：10.1021/jacs.9b03457

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本文成功合成過氧化銅納米點，並將其用於可激活的過氧化氫自給型化學動力學癌症治療。

背景介紹

A．化學動力學療法

作為一種新興的治療手段，化學動力學療法（CDT）利用芬頓或類芬頓反應產生高細胞毒性的羥基自由基（ OH）。芬頓和類芬頓反應在形成活性氧（ROS）過程中主要依賴於催化劑與 H2O2的相互作用，無需氧氣和外源能量輸入。因此，CDT 有望克服腫瘤光動力療法（目前最常用的基於 ROS 的治療手段）的一些難題，例如乏氧環境下 ROS 形成效率低、光穿透深度不足等。近來，CDT 試劑的開發受到廣大科研工作者的關注。目前，一些芬頓催化劑通過將癌細胞的內源過氧化氫（H2O2）轉化為 OH，從而實現癌症 CDT。然而，腫瘤細胞自身的內源 H2O2並不足以實現滿意的化學動力學療效。因此，發展具備增加細胞內 H2O2功能的化學動力學試劑是非常有意義的。

B．金屬過氧化物

增加細胞內 H2O2的手段主要分為兩種：內源 H2O2的放大產生和外源 H2O2的形成或遞送。由線粒體生成的內源 H2O2在靠近芬頓催化劑前，易被細胞內 H2O2酶和過氧化物酶等清除，利用率有限。因此，為了充分提高化學動力學療效，需製備能在芬頓催化劑周圍形成或釋放外源 H2O2的 CDT 試劑。金屬過氧化物由過氧基團和金屬離子組成，是一種可用於提供 H2O2的材料。而 Fe2+、Cu2+、Mn2+、Co2+等一些金屬離子已被報導具有良好的芬頓催化活性，所以我們有理由相信芬頓金屬過氧化物有望成為一種能自供 H2O2的 CDT 試劑。最近，有報導證實過氧化鐵可在下地幔環境中被合成（壓強：76 GPa，溫度：1800 K），但是當壓強小於 31G Pa 時過氧化鐵不能穩定存在。目前關於芬頓金屬過氧化物納米材料的報導甚少。

研究出發點

基於以上研究現狀及面臨的問題，陳小元研究員課題組合成了過氧化銅納米點，並將其用於可激活的過氧化氫自給型 CDT（圖1a）。實驗結果發現，過氧化銅納米點具有酸響應特性，能在弱酸性條件下分解並釋放 H2O2和具有類芬頓催化活性的 Cu2+，所伴隨發生的類芬頓反應可有效地產生 OH。被腫瘤細胞內吞後，過氧化銅納米點在酸性的胞內體/溶酶體中分解，形成的 OH 引起溶酶體脂質過氧化（LPO）和膜通透化（LMP），從而造成細胞殺傷。細胞和小鼠實驗均很好地證實了過氧化銅納米點的腫瘤化學動力學治療效果。作為特異性響應的增強型化學動力學治療製劑，過氧化銅納米點在癌症治療中具有良好的應用前景。相關研究結果以題為 「Synthesis of Copper Peroxide Nanodots for H2O2Self-Supplying Chemodynamic Therapy」 發表在 J. Am. Chem. Soc. 上。

圖文解析

A．過氧化銅納米點的合成與表徵

過氧化銅納米點可通過氯化銅、H2O2和氫氧化鈉在聚乙烯吡咯烷酮（PVP）水溶液中的簡單混合製備得到。通過透射電子顯微鏡（TEM）和動態光散射（DLS）表徵，可看出所製得的過氧化銅納米點大小約為 5 nm，平均流體動力學粒徑約為 16.3 nm（圖1b、c）。採用高錳酸鉀比色法和X射線光電子能譜（XPS）表徵驗證了過氧化銅納米點的過氧基團（圖1d，e）。同時，XPS 數據（圖1f）證明了過氧化銅納米點中銅元素為 +2 價。

圖1.（a）過氧化銅納米點的合成及其化學動力學治療應用示意圖。過氧化銅納米點的（b）TEM 圖和（c）動態光散射檢測。（d）高錳酸鉀比色法用於驗證過氧基團。PVP 包裹的過氧化銅納米點的（e）O 1s和（f）Cu 2p XPS 譜圖。

B．過氧化銅納米點的性能考察

通過改變不同的氫氧化鈉用量，我們發現無氫氧化鈉加入時過氧化銅無法形成，這說明了氫氧根離子的加入在過氧化銅形成過程中起了非常重要的作用（圖2a，b）。過氧化銅納米點在 pH 7.4 下保持穩定，而在 pH 5.5 溶液中銅離子被很快釋放（圖2c），表明過氧化銅納米點在弱酸性條件下可被分解形成 Cu2+和 H2O2。我們採用 TMB 染料作為 ROS 探針，發現 Cu2+能有效地催化 H2O2向 OH 的轉變（圖2d），並證實了過氧化銅納米點的弱酸性響應 OH 產生性能（圖2e）。

圖2.（a）過氧化銅納米點的形成、分解和 OH 產生示意圖。（b）氫氧根的加入在過氧化銅形成過程中的重要性。（c）過氧化銅納米點在不同 pH 下的 Cu 釋放。（d）Cu2+的類芬頓催化活性。（e）過氧化銅納米點在不同 pH 下的 OH 生成。

C．細胞實驗

為了考察過氧化銅納米點在細胞內的 ROS 形成，我們採用 DCFH-DA 作為指示劑，利用螢光共聚焦顯微鏡測定細胞內的 ROS 含量，結果如圖3a 所示。過氧化銅納米點孵育後的腫瘤細胞具有明顯高於空白對照組細胞的 ROS 水平。通過 MTT 實驗檢測細胞活性發現過氧化銅納米點能有效地抑制腫瘤細胞的生長（圖3b）。

眾所周知，ROS 可以破壞脂質、蛋白質和 DNA 等生物分子，從而具備殺傷細胞的能力。由於過氧化銅納米點具有 pH 響應性能，它可在酸性的胞內體和溶酶體中分解並發生類芬頓反應以產生 OH，從而導致溶酶體脂質過氧化和膜通透化，引起細胞凋亡。比率型螢光探針 C11-BODIPY581/591被選用為脂質過氧化探針（圖3c）。與空白對照組相比，過氧化銅納米點孵育後的腫瘤細胞中，紅色螢光減弱，綠色螢光增強，表明過氧化銅納米點能引起脂質過氧化。我們採用吖啶橙染色評估細胞溶酶體膜通透性，結果如圖3d 所示。過氧化銅納米點孵育後，癌細胞的溶酶體膜被嚴重破壞。

圖3.（a）不同濃度過氧化銅納米點孵育的細胞 DCF 螢光成像圖。（b）過氧化銅納米點孵育 24 h 的癌細胞存活率。（c）過氧化銅納米點孵育後，細胞脂質過氧化考察。（d）過氧化銅納米點誘發癌細胞溶酶體膜通透化。

D．小鼠實驗

由於過氧化銅納米點具有較小的流體動力學尺寸，可通過高滲透長滯留（EPR）效應被動富集於腫瘤組織。為了證實這一點，我們利用 ICP-OES 測量小鼠在尾靜脈給藥後 Cu 的分布情況（圖4a）。結果表明過氧化銅納米點能在腫瘤區域有效富集。再加上其 pH 響應的 OH 產生性能，過氧化銅納米點能有效抑制腫瘤生長（圖4b）。而且，治療組小鼠在治療期間並無明顯的體重變化（圖4c）。為了進一步證實化學動力學療效，我們對空白組和治療組的腫瘤切片進行 H&E 和 TUNEL 染色對比（圖4d，e）。實驗結果表明治療組小鼠的腫瘤切片細胞發生明顯的凋亡。

圖4.（a）尾靜脈給藥後過氧化銅納米點的分布情況。（b）治療期間腫瘤體積生長曲線。(c) 治療期間小鼠的體重變化曲線。腫瘤切片的(d) H&E 和（e）TUNEL 染色圖。

總結與展望

該研究製備了過氧化銅納米點，並利用其 pH 響應產生 OH 的性質，實現可激活的、H2O2自給的增強型化學動力學癌症治療。當被腫瘤細胞內吞後，過氧化銅納米點可在弱酸性的胞內體和溶酶體中分解成具有類芬頓催化活性的 Cu2+和 H2O2，伴隨的類芬頓反應所產生的 OH 引起溶酶體脂質過氧化和膜通透化，從而有效地誘導癌細胞死亡。EPR 效應腫瘤被動靶向和 pH 響應性能使得過氧化銅納米點能有效地抑制小鼠腫瘤生長。該工作不僅證明了芬頓金屬過氧化物納米材料在化學動力學治療中的應用潛力，也為增強型化學動力學製劑的研究提供新的設計思路。

文章連結：

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.9b03457