9引物延伸
引物延伸法主要用於mRNA 5'端作圖。製備的poly (A)+ RNA先與過量5'端放射性標記的、與靶RNA互補的單鏈寡核苷酸引物雜交，然後用反轉錄酶延伸引物。
產生的cDNA與RNA模板互補，並與寡核苷酸引物5'端和RNA 5'端之間的距離相等。以往引物延伸也用於其他目的：測定某個靶mRNA的豐度，確定mRNA的前體和加工中間體( 綜述見Boorstein and Craig 1989)。
然而，由於有更高的靈敏度，現在更優先使用核糖核酸酶保護和核酸酶S1實驗。儘管如此，在mRNA 5'端作圖時引物延伸法仍為首選方法。
一旦引物被起始合成，延伸反應大多會進行到RNA模板的5'端，產物的大小可以被高精度測定。此外，產物的長度不會受到靶基因內含子分部和大小的影響，而這能通過與基因組模板：雜交來幹擾mRNA的作圖。
再依賴於雜交體消化的實驗中，如核酸酶S1和核糖核酸酶保護，mRNA 5'端的短外顯子很容易被遺漏。幾乎所有的引物延伸反應實驗都採用20~ 30nt的合成寡核苷酸引物(更多細節見第13章)。
當用於和靶序列雜交的寡核苷酸引物位於距mRNA 5'端150nt 以內時，可以獲得最佳結果。由於反轉錄酶會在模板RNA的高度二級結構區域停頓和終止，在更遠的距離處雜交會生成不均一的延伸產物。
因此，在設計引物時，除實際的序列外，還要考慮到雜交的位置。應儘可能使寡核苷酸引物的GC含量在50%左右，且在3』端為G或C.用兩個引物在mRNA相距一段已知距離(如20~ 50Ont)的區域上分別雜交則更為理想。