在很多反轉錄病毒中，核糖核酸酶H與多功能酶的反轉錄酶有關，在病毒基因組轉錄成DNA的多個階段中執行重要功能。
在真細菌中，核糖核酸酶H確信在以下方面是必需的：從Okazaki片段去除RNA引物時、在轉錄物進入DNA聚合酶I啟動DNA合成所用引物的轉錄過程時，以及在去除R-環為在大腸桿菌染色體複製起點提供不規則DNA合成的條件性起始位點時。
在真核細胞中，核糖核酸酶H也可能執行類似的功能。據報導，核糖核酸酶H可顯著地增強反義寡脫氧核苷酸對基因表達的抑制作用，這些寡核苷酸和mRNA中的特定序列雜合子對此酶的降解敏感。
核糖核酸酶H在體外啟動對在Colicin E1( pColE1)型質粒的原始部位(Ori) 的複製是必需的。此酶似乎也抑制啟動非Ori部位的DNA合成。X射線晶體成像分析顯示，大腸桿菌核糖核酸酶H含有兩個結構域，其中一個含Mg*結合位點，與一種前不久在DNA聚合酶I中被認識的摺疊鏈吻合。
大腸桿菌dut基因編碼dUTP酶，它是一個含鋅的四聚焦磷酸酶(分子質量64000Da)。在dut突變體中，細胞轉化dUTP為dUMP的能力受損，這導致細胞中dUTP池的水平，上升25~ 30倍，從而造成dUTP/dTTP的比例上升，使得dUTP摻入本應由dTTP佔據的位點的頻率上升。
在Kunkel方法中使用的dut突變型的大腸桿菌都含有痕量的dUTP酶活性，也許是因為完全缺乏這個酶活性會致死(el-Haj et al. 1988)。