達爾文已經意識到物種隨時間環境發生變化，接下來的思考是什麼力量推動物種的進化？
達爾文兒童時期在農場度過，其實苦心尋覓的部分答案就在眼前，而這就是我們所說的變異，即動物有時會產生與親本類型特徵不同的後代。長期以來，農民們一直在利用這種現象對動物進行繁育和雜交，並且通過多次傳代從發生自然變異的後代中進行選擇。作為一名充滿好奇心的博物學家，當達爾文從遙遠的加拉帕戈斯群島回到英格蘭時，他出乎意料地發現每個地區都擁有自己的奶牛品種。不過達爾文與那些飼養員都明白，動物的繁育過程絕非偶然事件。雖然這些奶牛來源於共同的原始祖先，但是人們卻可以通過選擇育種創造出新的品種。
達爾文知道，將物種變異與人工選擇進行巧妙地組合將產生驚人的效果。鴿子可以看起來像公雞或孔雀，而狗可以有短毛、長毛、雜色、花斑、弓形腿、無毛、直立尾、兇狠、溫順、膽小、謹慎以及好鬥等性狀。但是，最終改變奶牛、狗與鴿子性狀的力量還是掌握在人類手中。
1798年，馬爾薩斯以筆名發表了《人口論》（An Essay on the Principle of Population）這篇頗具煽動性的文章，他認為人口增長與有限資源之間的矛盾無法調和。馬爾薩斯據此推斷，隨著人口不斷增長，生活資料將逐漸耗盡，個體之間的競爭將變得更加激烈。隨後人類社會將面臨世界末日的考驗，「各種流行病和瘟疫肆意泛濫，數以萬計的生命會因此終結」，最後「食物將在人口之間」重新分配。那些僥倖逃過「自然選擇」的人會再次面對這種殘酷的循環，就像希臘神話中絕望的西西弗斯（Sisyphus），而人類也將在饑荒的脅迫下四處流浪。
在馬爾薩斯的文章中，達爾文終於找到了他夢寐以求的答案。達爾文寫到「我突然想到，在這種環境下（自然選擇），有利變異將被保留而無利變異將被清除。其結果就是形成某個新的物種。」最能夠適應環境的個體，意味著最適合生存（「適者生存」源自馬爾薩斯主義經濟學家赫伯特·斯賓塞）。然後這些倖存者將會產生更多類似的後代，推動物種內部發生進化。
1839年，達爾文完成理論框架的概述；1844年將關鍵精煉成255頁的文章寄給朋友私人閱讀，並未對外正式發表。
1855年，名叫阿爾弗雷德.拉塞爾.華萊士的年輕博物學家發表了一篇和達爾文理論極其相似的文章。華萊士在馬來群島發現河道內近緣物種之間的差異令人吃驚。華萊士重新回顧了馬爾薩斯的文章。「答案顯而易見……適者生存……只要通過這種方式，動物機體的任意部分都可以根據需要發生改變。」甚至於他的思想語言（變異、突變、生存與選擇）都與達爾文的著述存在驚人的相似。儘管加拉帕戈斯與馬來群島相距遙遠，但是這兩位背景迥異的科學家最終卻殊途同歸。
1858年6月，華萊士將自己概括的自然選擇理論寄給了達爾文，達爾文對華萊士理論和自己的相似性感到震驚，驚慌失措至於帶著自己的手稿找到賴爾，賴爾建議他將兩篇論文同時提交給即將召開的林奈學會會議，這樣兩人可以共同分享此項發現帶來的榮譽。
達爾文原本打算將所有發現整理完成後一併發表，可是他現在只能在倉促之間完成這部具有重要意義的著作。1859年11月24日，達爾文《物種起源》正式出版發行，首印1250本，當天售罄。達爾文的理論在受到熱捧的同時也招致了多方的批判。或許達爾文頗有先見之明，他謹慎地表達了該理論對於人類進化的意義：《物種起源》通篇只有一行敘述涉及人類祖先，「人類的起源與歷史終將得以闡明」，這也許是那個時代謙卑的科學表述。