概述免疫治療的起源與發展史(上)_PD-1/PD-L1_nivolumab_CTLA-4...

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免疫治療包括激活免疫療法和抑制免疫療法，分別通過誘導、增強或抑制免疫應答來治療疾病。廣義來說，基於人體免疫系統，例如通過免疫分子（如抗體、細胞因子治療等）、免疫細胞（如體外提取和/或擴增的淋巴細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、天然殺傷細胞、血小板等）而開發的治療方案都屬於免疫治療的範疇。

在癌症治療方面，傳統的治療方法包括細菌/病毒感染增強免疫反應、腫瘤疫苗免疫等。最早的腫瘤免疫治療案例可以追溯到1893年，紐約骨科醫生William Coley意外地發現，骨肉瘤患者在手術切除腫瘤後被化膿性鏈球菌感染能夠導致癌症消退，這是感染促進免疫反應從而治癒癌症的實例；溶瘤病毒治療更是一種具有上百年研究歷史的免疫治療策略，但是長期以來成效甚微，隨著基因工程技術的進步、病毒改造技術的完善，溶瘤病毒療法才有了進展。

目前，FDA批准上市的溶瘤病毒只有一種，即2015年10月批准上市的lmlygic （Talimogene laherparepvec），也稱為T-VEC，一種經過基因改造的單純皰疹病毒，用於皮膚及淋巴結黑色素瘤的治療。一項在436位不可切除的黑色素瘤患者中的III期臨床試驗顯示，接受Imlygic治療的研究受試者有16.3%的人其皮膚及淋巴結中黑色素瘤病灶減小，並且這種減小持續至少6個月，相比之下，接受對照藥物治療的受試者中僅有2.1%的人病灶減小[J Clin Oncol. 2015 Sep 1;33(25):2780-8.]；癌症疫苗通常是利用樹突細胞負載腫瘤特異抗原遞呈並激活宿主T細胞引發抗瘤免疫應答。

然而目前為止，無論使用單一抗原（如MAGE-A3用於非小細胞肺癌）、還是癌細胞裂解物（如GVAX）都沒有取得明顯進展，目前全球只有1個治療性DC疫苗Sipuleucel-T（Provenge）被批准上市，包括患者DC提取、荷載前列腺癌特異抗原、回輸體內等多個步驟。患者死亡風險降低了33%，顯示了一定的生存改善[Cancer. 2009 Aug 15;115(16):3670-9.]。 

近年來，新興的腫瘤免疫療法蓬勃發展。1984年，美國國立癌症研究院（NCI）的Steven Rosenberg團隊首次應用大劑量IL-2與LAK細胞協同治療25例腎細胞癌、黑素瘤、肺癌、結腸癌等腫瘤患者，其中11例腫瘤縮小超過50%，1名33歲的轉移性黑色素瘤患者腫瘤完全消退，給腫瘤免疫治療帶來一線曙光。這是癌症「過繼細胞療法」（Adoptive cell transfer，ACT）成功的首個例子。

1988年Steven Rosenberg團隊總結了IL-2與LAK細胞協同治療222例腫瘤患者的整體療效，指出其中16例患者腫瘤轉移灶完全消退，26例患者腫瘤消退50%以上，提示該療法對轉移性腎細胞癌、黑素瘤、結腸癌和非何杰金氏淋巴瘤患者的療效較顯著 [Science. 1984 Sep 28;225(4669):1487-9.][ J Clin Oncol. 1989 Jan;7(1):7-20.]。

LAK細胞是指淋巴因子激活的殺傷細胞（lymphokine activated killer cells），將外周血淋巴細胞在體外經IL-2激活3～5天而擴增為具有廣譜抗瘤作用的殺傷細胞，先後有多個基於LAK細胞的臨床試驗顯示其具有一定的療效；然而，大劑量IL-2的副作用很大，因此研究者們嘗試了一系列新型細胞療法，採用體外提取/篩選、活化並回輸自體/異體CIK、腫瘤特異性T細胞、腫瘤部位浸潤淋巴細胞（tumor infiltrating lymphocyte,TIL）等細胞進行腫瘤過繼免疫治療，顯示了一定的刺激機體免疫系統、殺傷腫瘤、延長患者生存期和/或無進展病程的療效[Fujita K, Ikarashi H, Takakuwa K, Kodama S, Tokunaga A, Takahashi T, Tanaka K (May 1995). "Prolonged disease-free period in patients with advanced epithelial ovarian cancer after adoptive transfer of tumor-infiltrating lymphocytes". Clin. Cancer Res. 1 (5): 501–7.][Kimura H, Yamaguchi Y (July 1997). "A phase III randomized study of interleukin-2 lymphokine-activated killer cell immunotherapy combined with chemotherapy or radiotherapy after curative or noncurative resection of primary lung carcinoma". Cancer. 80 (1): 42–9. ][Takayama T, Sekine T, Makuuchi M, Yamasaki S, Kosuge T, Yamamoto J, Shimada K, Sakamoto M, Hirohashi S, Ohashi Y, Kakizoe T (September 2000). "Adoptive immunotherapy to lower postsurgical recurrence rates of hepatocellular carcinoma: a randomised trial". Lancet. 356 (9232): 802–7. ][Kono K, Takahashi A, Ichihara F, Amemiya H, Iizuka H, Fujii H, Sekikawa T, Matsumoto Y (June 2002). "Prognostic significance of adoptive immunotherapy with tumor-associated lymphocytes in patients with advanced gastric cancer: a randomized trial". Clin. Cancer Res. 8 (6): 1767–71. ]。

例如，1986年Steven Rosenberg研究組首先報導了腫瘤浸潤淋巴細胞（tumor infiltrating lymphocyte,TIL）[Science. 1986 Sep 19;233(4770):1318-21.]；1991年，Weissman首次報導了在荷瘤小鼠進行CIK（cytokine induced killer）細胞療法的評估[J Exp Med. 1991 Jul 1;174(1):139-49.]；2002年，Steven Rosenberg團隊在Science雜誌發文稱，在轉移性黑素瘤患者中過繼輸注腫瘤特異性T細胞，能夠使得患者的癌症消退[Science. 2002 Oct 25;298(5594):850-4. Epub 2002 Sep 19.]等。

值得一提的是，CIK細胞在發現之初是一群正常人外周血中只佔1～5%的CD3+CD56+、CD3+CD8+ T淋巴細胞，該細胞群可以在IL-2､IFN-γ等細胞因子及單抗(如抗CD3單抗)的刺激下，在體外由從外周血､骨髓或臍血中分離出來的單個核細胞培養擴增而成，具有非MHC限制的廣泛的強殺瘤活性，故又稱為NK 細胞（自然殺傷細胞）樣 T 淋巴細胞。

由於利益驅使、國內患者需求以及臨床科研大環境的推動， CIK細胞免疫療法一度在國內臨床實踐中異常火爆，曾被認為是國內癌症臨床治療趕超國外的契機。然而，2016年發生的魏則西事件將DC-CIK細胞治療技術推上了風口浪尖，揭露了細胞免疫療法在國內臨床界的亂象，一夜之間相關臨床試驗便陷入停滯。

DC-CIK細胞治療技術是一個具有中國特色的詞語，是將DC細胞和CIK聯合對患者進行過繼免疫治療。在pubmed搜索DC-CIK，共89篇論文，幾乎全部都是中國研究者發表的，署名作者中單位為USA的只有2篇，且這2篇文章第一作者均為國內的臨床醫生。

曾幾何時，國內進行基礎研究的有識之士大聲疾呼取消/禁止亂象紛呈的細胞免疫治療，代替以國外已經經過臨床試驗證實的、真正有效的/已上市的免疫療法並將其納入醫保，例如治療性抗體、免疫檢查點（Immuno-checkpoint）抗體、CAR-T療法等。

近年來，癌症免疫治療發展迅猛，特別是抗體藥物的發展令人矚目，截止2016年底，FDA先後批准了約五十種抗體藥物上市，其中大多數是針對癌症治療的單抗藥物。目前，基於抗體發展的多種腫瘤治療的策略中，除了直接靶向癌細胞表面特殊抗原（如CD20、HER2等）外，還有靶向血管生成因子VEGF切斷腫瘤營養供給、雙功能抗體（如BiTE）、放射物質/毒素偶聯「裸抗」殺傷活性的模式。

特別是近年來阻斷CTLA4、PD-1/PD-L1等免疫檢查點分子從而增強T細胞殺傷活性、基於單鏈抗體（ScFv）的結構設計嵌合抗原受體T細胞（Chimeric Antigen Receptor–Modified T Cells，CART）等新型免疫療法均在臨床上取得了突出的療效，被認為是最具前景的腫瘤免疫治療策略（圖1）。

2012年，Carl H. June使用CAR-T療法治癒了6歲患白血病女孩Emily，引起了全球轟動，而到目前為止，Emily的癌細胞已經完全消失了5年。2013年，《科學》雜誌將免疫治療列為年度十大科學突破之首，這也讓免疫療法再次成為全球研發的熱點。

圖1 基於抗體的癌症治療策略 [Nat Rev Cancer. 2015 Jun; 15(6): 361–370.building better monoclonal antibody-based therapeutics]

1、腫瘤免疫調節抗體

眾所周知，體內表達TCR的T細胞是參與特異性免疫應答的主要細胞，而TCR在特異性識別抗原呈遞細胞（antigen-presenting cell，APC）所提呈的抗原肽的過程中，必須同時識別與抗原肽形成複合物的MHC分子；同時，免疫應答還需要免疫調節分子的參與。

一般認為，參與機體免疫調節的分子包括以下三類：1、免疫負調控分子，包括表達於活化T細胞表面的CTLA-4、PD-1以及表達於天然殺傷（NK）細胞表面的KIR家族。

例如CTLA-4與B7的結合能夠有效抑制 T 細胞增殖；2、免疫共刺激受體，包括表達在CD4+和CD8+T細胞表面的TNFR超家族成員OX40、GITR等，如B7與T細胞表面CD28結合能夠激活T細胞；3、可溶性免疫抑制因子，如TGFβ1。

圖2顯示了重要的T細胞免疫調節分子[Nat Rev Cancer. 2012 Mar 22;12(4):252-64.]。其中，靶向CTLA-4、PD-1等分子的治療性抗體已經成功上市，為腫瘤治療開創了新的理念。

圖2  T細胞免疫調節分子

（1）抗PD-1/PD-L1抗體

PD-1是免疫負性調控分子，與其配體PD-L1或PD-L2作用可下調T細胞活性，使得腫瘤逃逸免疫系統的識別和殺傷，而抗PD-1/PD-L1抗體可以逆轉這一抑制效應（圖3）。2014年，FDA批准了首個抗PD-1抗體，即默克公司的Keytruda（通用名：pembrolizumab），用於晚期黑色素瘤的治療。它和後來被批准上市的抗PD-1抗體Opdivo（百時美施貴寶開發，通用名：nivolumab）都曾獲得過FDA突破性藥物稱號。

Opdivo被批准的雖然較晚，但是進展迅速，已經被批准用於轉移性惡性黑色素瘤、鱗狀非小細胞肺癌、腎癌的臨床治療。2015年，美國副總統卡特罹患黑色素瘤並發生腦轉移，但僅僅4個月後就傳來好消息，卡特的癌症已經被治癒，除了傳統的手術、放療，Keytruda也起了不容忽視的鞏固效果。關於PD-1抗體的研究將另文專述。

圖3  抗PD-1/PD-L1抗體作用機制示意

（2）抗CTLA-4抗體

CTLA-4全稱為細胞毒性T細胞相關抗原-4（cytotoxic T lymphocyteassociated protein 4，亦名CD152），是一種表達於T細胞表面的免疫負調節分子。CTLA-4能夠結合APC表面的配體CD80/CD86，抑制T細胞的激活，減弱機體對腫瘤細胞的免疫應答。

因此，抗CTLA-4抗體能夠恢復T細胞激活信號，增強T細胞活化和增殖，恢復免疫系統識別並攻擊癌細胞的能力，通過T細胞介導的免疫應答而發揮抗腫瘤作用[Freeman GJ, Gribben JG, Boussiotis VA,et al.Cloning of B7-2: a CTLA-4 counter-receptor that costimulates human T cell proliferation. Science 1993; 262:909-911.][Linsley PS, Greene JL, Brady W,et al.Human B7-1 (CD80) and B7-2 (CD86) bind with similar avidities but distinct kinetics to CD28 and CTLA-4 receptors. Immunity 1994; 1:793-801]；

此外，抗CTLA-4抗體還可通過Fcγ受體依賴方式介導調節性T細胞的消耗，從而上調效應T細胞的比例，逆轉免疫抑制狀態的T細胞，增強機體抗腫瘤能力（圖4）。

圖4   CTLA-4抗體作用機制示意[Blank CU. The perspective of immunotherapy: new molecules and new mechanisms of action in immune modulation. Curr Opin Oncol. 2014;26(2):204-14.]

Ipilimumab/Yervoy是BMS公司研發的抗CTLA-4抗體藥物（全人IgG1），於2011年被FDA批准上市，用於不可手術或轉移性黑色素瘤患者。實驗表明，Ipilimumab使用後可以引起淋巴細胞激活，表明抗體可以增強患者的免疫力[Matzinger P, Kamala T. Tissue-based class control: the other side of tolerance. Nat Rev Immunol 2011; 11:221-230.]。

臨床數據顯示，III或IV期黑色素瘤患者用gp100肽疫苗和/或Ipilimumab 進行治療後，抗體的使用能夠延長總體生存時間，比疫苗單用組增加了3.6個月（10個月 vs 6.4個月）[N Engl J Med. 2010 Aug 19;363(8):711-23.]；

在肺癌中，Lync h等[J Clin Oncol. 2012 Jun 10;30(17):2046-54.]報導了一項Ipilimumab聯合紫杉醇/卡鉑治療IIIb/IV期NSCLC的Ⅱ期臨床試驗，結果顯示，Ipilimumab能夠延長無疾病進展期，順序治療、同步治療和對照組中位生存期分別為12.2月、9.7月和8.3月，且鱗癌患者優於非鱗癌患者；

此外，Ipilimumab對小細胞肺癌也有一定的療效，聯合紫杉醇/卡鉑治療小細胞肺癌（ED-SCLC）的Ⅱ期臨床試驗中，順序治療、同步治療和對照組中位生存期分別為12.94月、9.13月和9.92月，順序治療有改善生存期的趨勢[Ann Oncol. 2013 Jan;24(1):75-83.]。

阿斯利康公司開發的Tremelimumab是一種抗CTLA-4抗體（全人IgG2），於2015年被FDA批准為孤兒藥，用於惡性間皮瘤的治療[Lancet Oncol. 2013 Oct;14(11):1104-11.][Lancet Respir Med. 2015 Apr;3(4):301-9.]。

儘管如此，tremelimumab未能改善IIb期患者的生存期，因此，Tremelimumab被列為不可切除的惡性間皮瘤的二或三線治療方案[Lancet Oncol. 2017 Jul 17. pii: S1470-2045(17)30446-1.]。目前，Tremelimumab在其他腫瘤中的臨床試驗也正在開展，但是還沒有適應症獲批。同時，阿斯利康正在將Tremelimumab與旗下抗PD-L1抗體Durvalumab（MEDI4376）組合，在非小細胞肺癌（NSCLC）中進行臨床III期試驗[Clin Lung Cancer. 2016 May;17(3):232-236.e1.]；在轉移或復發性胃癌中進行的研究也已經進入臨床II期階段。

除了抗CTLA-4、PD-1/PD-L1等抗體，還有多個免疫調節抗體正處於臨床期試驗階段(見表1)。

表1  部分處於臨床試驗的腫瘤免疫調節抗體

2、CAR-T

嵌合抗原受體（Chimeric antigen receptor，CAR)是利用逆轉錄病毒載體將外源抗體/蛋白（如scFv）等呈現在細胞表面所形成的受體。目前廣受關注的CAR-T療法就是將CAR呈現在T細胞表面並進行過繼細胞免疫治療的方法。CAR-T療法的全稱是Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy，即嵌合抗原受體T細胞免疫療法。

CAR-T是對T細胞進行基因轉染，使其表面能夠表達特異性識別腫瘤細胞的抗體，從而介導T細胞殺傷癌細胞（圖5）。

T細胞可以來自於患者自體或者異體，而轉染T細胞的方法通常採用慢病毒和逆轉錄病毒，還有利用SB轉座子等系統成功製備的CAR-T細胞的報導[J Clin Invest. 2016 Sep 1;126(9):3363-76.]，顯示在晚期非霍奇金淋巴瘤和急性淋巴細胞白血病患者中，CAR-T離體擴增倍數達2200~2500倍，且自體CAR-T治療後30個月的癌症無進展率和總生存率分別為83％和100％，而同種異體CAR-T治療後12個月的數據分別為53％和63％。

圖5  CAR-T細胞過繼細胞療法

最早的CAR-T療法主要是單一的靶向B淋巴瘤CD19和CD20的scFv。而優化後的CAR-T最常見的形式是scFv與CD3ζ胞內信號域融合，從而在scFv結合癌細胞後傳遞ζ信號，增強T細胞的殺傷能力。目前在研的CAR-T療法進一步在此基礎上進行了改進，加入了共刺激分子CD28、4-1BB/OX40等，增強了CAR-T細胞的擴增能力和細胞因子分泌水平，延長體內存活時間（圖6）。2012年，治癒了Emily的就是諾華開發的二代CD19 CAR-T。

隨即，Cruz等[Blood. 2013 Oct 24;122(17):2965-73.]在同種異體幹細胞移植後的B淋巴細胞瘤復發患者中，利用異體T細胞製備CD19 CAR-T進行臨床I期研究。結果顯示，CAR-T安全有效，8名患者，在血液中可以存活8周，在疾病部位可以持續9周。2例患者腫瘤消退明顯，另有2例患者在CAR-T維持期間疾病無進展；Wang等[Blood. 2016 Jun 16;127(24):2980-90.]比較了含有CD3ζ結構域的CAR-T（CD19R：ζ）和新一代含有CD28和CD3ζ的CAR-T（CD19R：28ζ）。

8例CD19R：ζ治療患者中，4例在1年和2年後疾病無進展，在8名CD19R：28ζ患者中，6例1年無進展。同時，CD19R：28ζ CAR T細胞的早期增殖較好，儘管持續時間≤28天。在兩組中都沒有出現嚴重的細胞因子釋放症候群，顯示了這種免疫療法的安全性和可行性（‍‍www.clinicaltrials.gov 臨床試驗註冊號為＃NCT01318317和＃NCT01815749）‍。‍

圖6  各階段CAR-T的結構示意圖（綠色為scFv）

治癒Emily的CAR-T療法就是諾華開發的CTL019。CTL019已經於2014、2017年7月連續被FDA給予突破性療法地位，分別被批准用於治療兒童和年輕成年患者的復發性/難治性B淋巴瘤、急性淋巴細胞白血病（ALL）（2014），以及用於2種或以上治療方案失敗的、復發性和難治性成人瀰漫大B淋巴瘤。CTL019是嵌合了CD3ζ/4-1BB胞內域的CD19 CAR-T療法，利用慢病毒轉染T細胞。

臨床研究顯示[N Engl J Med. 2014 Oct 16;371(16):1507-17.]，30名接受CTL019治療的患者中，27例患者完全緩解，其中包括曾接受單抗治療復發和骨髓移植的患者。6個月後無進展生存率為67％，總生存率為78％。即使在幹細胞移植失敗的患者中，也觀察到長達24個月的病情持續緩解。所有患者都有細胞因子釋放症候群，利用抗IL-6受體抗體tocilizumab能夠有效控制（ClinicalTrials.gov編號NCT01626495和NCT01029366）。

不過，CTL019也存在副作用，需要良好的臨床護理和幹預。例如，39名復發/難治性急性淋巴細胞白血病患者中開展的CTL019臨床I/IIa期試驗結果顯示，18例發生3-4級細胞因子釋放症候群，出現發燒、高鐵蛋白血症、器官功能障礙。

14例心血管功能障礙，6例發生急性呼吸衰竭等急性臨床反應[Crit Care Med. 2017 Feb;45(2):e124-e131.]。2017年8月30日，FDA批准了諾華公司的CAR-T療法CTL-019（tisagenlecleucel-T）上市，目前僅用於治療25歲以下的難治性、復發性白血病患者。FDA同日批准了人源化抗人IL-6單抗Actemra（tocilizumab）的新適用症，用於治療CAR-T細胞治療引起的細胞因子釋放症候群。

除了CTL019，針對CD19分子的CAR-T療法還有JUNO公司的JCAR014、JCAR015、JCAR017，以及Kite公司開發的axicabtagee ciloleucel（KTE-C19）。其中，KTE-C19是嵌合了CD3ζ/CD28胞內域的CD19 CAR-T療法，利用逆轉錄病毒轉染T細胞。

在7例難治性瀰漫性大B細胞淋巴瘤患者中的研究顯示，5例患者對KTE-C19治療有應答，4例完全緩解，3例隨訪超過12個月,且病情持續緩解；CAR-T細胞在2周內達到峰值擴張，並且能夠連續12個月被持續檢測到。副作用方面，發生1例4級細胞因子釋放症候群，4例神經毒性，但在1個月內這些嚴重反應均被控制[Mol Ther. 2017 Jan 4;25(1):285-295.]；

此外，在101例非霍奇金淋巴瘤患者中，客觀緩解率高達82%，在8.7個月的中位隨訪時間內，44%的患者持續緩解，其中39%為完全緩解。KTE-C19於2017年5月獲得FDA的優先審評資格，7月31日獲得EMA的加速審批資格，適應症為瀰漫性大B 細胞淋巴瘤/原發性縱隔B 細胞淋巴瘤/轉化的濾泡性淋巴瘤，有望在2017年底前上市。

此外，FDA已經批准了Kite 公司CAR-T療法KITE-585的申請，近期將啟動1期臨床試驗，用於多發性骨髓瘤的治療。KITE-585的靶點是BCMA蛋白，表達於大部分此類患者的惡性漿細胞表面，而且除了正常漿細胞和特定的成熟B細胞，其他組織不會表達BCMA，可以預見KITE-585較強的特異性和靶向性。

近期，iCell開發的CD4CAR由FDA授予孤兒藥資格，用於治療CD4+T淋巴瘤。CD4CAR是基於CD8+細胞毒性T細胞（CTL）開發的CAR-T療法，使其表達抗CD4抗體，識別CD4+T淋巴瘤細胞。體外數據顯示，CD4CAR T細胞能夠識別CD4+細胞，有效地清除CD4+腫瘤細胞系和原發性患者CD4+腫瘤細胞。體內試驗顯示，CD4CAR T細胞顯著延長了小鼠的存活時間 [Leukemia. 2016 Mar;30(3):701-7.]。

表2  部分已完成的CAR-T臨床試驗 (截止2017.8)

除了以上CAR-T療法實例，目前還有很多臨床試驗正在進行中（表2）。需要注意的是，CAR-T還存在明顯的不足，例如費用高、患者個體化差異大、人工製備T細胞對技術的要求高、攻擊正常組織產生「脫靶效應」等，而且在實體瘤中的療效還有待評價，特別是容易產生嚴重的細胞因子釋放症候群，需要在治療過程中嚴密監控並加強護理。

例如，Lee等[Lancet. 2015 Feb 7;385(9967):517-528.]利用CD19 CAR-T進行的臨床I期研究中，19例急、慢性淋巴細胞白血病或B淋巴瘤患者接受了治療，其中3例發生4級細胞因子釋放症候群、9例發熱、9例低血鉀症等。特別是在使用新一代CAR-T時更需要小心，因為CAR-T細胞體內清除更慢。此外，未來對於CAR-T療法靶點的選擇也需要更深入的研究。

例如，目前認為，腫瘤幹細胞是腫瘤分化增殖的關鍵因素，它參與腫瘤的發生、轉移、進展以及耐藥，因此，製備腫瘤幹細胞特異性靶抗原CAR-T或許可以從「源頭」抑制腫瘤。這些靶抗原可能包括CD44、CD133、ABCG2等。

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