AM|高精度單細胞列印實現生物結構的逐細胞製備

2020-12-03 上普生物

近期，UCSF的 Adam Abate團隊在Advanced Materials期刊上發表了「HighDefinition SingleCell Printing: CellbyCell Fabrication of Biological Structures」的文章。

摘要：生物列印是一項強大的技術，具有改變醫療設備製造，器官替代以及疾病和生理畸形治療的潛力。但是，當前的生物印表機無法可靠地列印所有生物的基本單元，即單細胞。本文介紹了一種高清晰度的單細胞列印技術，它是一種新穎的微流控技術，可以準確地列印多種候選對象中的單個細胞。該生物印表機採用高度微型化的微流分選機確定性地選擇感興趣的單個細胞進行列印，從而實現了≈10m的精度和≈100Hz的速度。通過選擇性的單細胞列印製作具有預定義功能的複雜細胞圖案，證明了這種方法。該方法用於合成成分和形態受控的定義明確的球體。該方法的速度，準確性和靈活性將推動生物列印的發展，從而使類器官科學，組織工程學和空間靶向細胞療法的新研究成為可能。

單細胞列印原理

組裝具有可控細胞尺度特性的生物結構的當前方法依賴於介導細胞相互作用。例如，這可以通過使用DNA控制細胞聚集或將DNA印刷到基質上以將細胞分組到所需位置來實現。但是，用這些方法構造複雜的多層結構尚未完成。一種從細胞生成精細結構的方法是將3D列印的靈活性與螢光激活細胞分選（FACS）的細胞選擇性結合起來。然而，將細胞選擇性整合到生物列印中的方法笨拙且緩慢，而流式細胞儀則缺乏以微米解析度分配細胞的精度。用FACS限制精確細胞列印的主要挑戰是其大型分選機帶有帶電的靜電板，從而無法使分選機出口靠近基材。因此，本研究的核心創新是一種小型化的細胞分選儀，該分選儀可實現FACS的速度和選擇性，同時又足夠小，幾乎可以與基材接觸。從分選機到基板，列印的單元僅移動≈3mm，提供的精度為≈10m（圖1）。通過將此細胞分選儀與3D列印組件（包括機械平臺）結合使用，並使用計算機控制系統，可以列印高解析度結構。基質在x–y平面上的定位由機械平臺控制，從而使計算機可以將細胞分選與基質對齊。為了列印所需的結構，我們向計算機提供了將單元類型分配給每個基板「像素」的指令。計算機逐個像素地遍歷基板，分配所需的單元格。

圖1 單細胞列印原理

為了選擇性地列印細胞，用螢光染料標記細胞，使其能夠通過流式細胞術測量來識別。霧化是通過在集中的氣流中剪切細胞懸浮液而發生的，從而產生包含單個細胞的單分散液滴。這種設計可實現直徑受控的均勻液滴。隨空氣和水的流速變化，研究者使用30×30 m噴嘴產生直徑36至50 m的液滴，使用70×70 m噴嘴產生直徑105至210 m的液滴。因為研究者使用順流幾何形狀，所以在「滴落」狀態下運行時會形成單分散的液滴。生成後，聚集的空氣使液滴加速通過光學檢測器，該檢測器會掃描液滴中的細胞（圖2）。螢光信號由四色檢測器實時分析，並根據預定義的門控參數對細胞進行分類。由於將所需細胞從混合懸浮液中選出後，就可以將分選視為將特定細胞按需遞送至給定位置的策略。

傳統的流式細胞儀中，細胞分選是通過液滴的帶電和電場偏轉來實現的。然而，這些儀器無法在精確的細胞印刷所需的緊湊空間中實現足夠的細胞偏轉。因此，研究者開發了一種基於介電電泳的新型細胞分選機制，該機制利用了導電液滴與絕緣周圍環境之間的介電常數差異。通過改變施加的電壓可以調節介電泳的液滴偏轉。因此，電極通電可在偏轉的液滴路徑（圖2b中的電極接通）或筆直的液滴路徑（圖2c中的電極斷開）之間切換。因為分類的目的是分配某些液滴並丟棄所有其他液滴，所以偏轉的液滴不得撞擊基材。為了確保這一點，研究者在電極的下遊包括一個真空通道（圖2a）。真空不會改變未偏轉液滴的運動，但是會捕獲偏轉的液滴（圖2b）。

圖2 單細胞列印的分選和實現

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單細胞噴射能力檢驗

通過分選系統，可以將噴射的含細胞率由10%提升至95%。總體而言，使用研究者目前的儀器可以在≈50Hz的頻率下進行精確的單細胞列印，以這種速率，可以在≈40分鐘內列印出由20 m單元組成的1立方毫米構造。並可以實現不同螢光細胞的分選，實現多細胞的按結構/設計的列印製造。同時，結果說明分選過程溫和並且不會顯著降低細胞活力或增殖。

圖3 墨水的流變特性

列印精度和組合列印能力

在陣列上列印定義的細胞組合對於在細胞生物學和篩選中的應用很有用，但是可用的生物印表機缺乏在精確位置列印細胞組合的能力，並且不能包含特定數量的不同細胞類型。而研究者的方法可以準確地列印大型和複雜的細胞陣列。

對於3到5 mm的列印距離，獲得的平均精度約為≈8 m。並可以列印條件更系統地變化的更複雜的陣列，例如每個點交替五個單元，以及紅色和綠色單元組成的線性變化（圖4c）。通過機械平臺可以通過更精細，更複雜的運動範圍進行平移，從而可以列印任何2D圖案。研究者了列印具有相同輪廓但細胞密度不同的「 UCSF」（圖4d）。要列印多色圖像，我們用不同的染料對細胞染色，並列印不同顏色的100個單元的正方形（圖4e）。通過2D圖案的逐層列印，可以生成3D結構（圖4f）。這種基本能力允許製造由受控細胞類型組成的空間異質結構。作為最後的演示，研究者從綠色單元格中列印出一個高約2毫米的艾菲爾鐵塔（圖4g）；該圖像的解析度大約是標準噴墨印表機的十倍。

圖4 墨水的列印性能

類器官球體的構建

多細胞球體提供了生理學的3D微環境，並且正在成為類器官研究和組織工程構建模塊的有用模型。但是，現有的產生球體的方法缺乏控制。標準方法是將細胞大量混合併隨機聚集。但是，這將對成分的控制降到最低，並生成極其不均勻的球體。或者，可以通過聚集孔中的細胞並利用限制約束組裝來提高均勻性。以相似原理操作的微流體方法產生相似的結果。儘管這些方法比本體形成要好，但由於聚集是隨機的，並且產生具有隨機組合的橢球，因此這些方法對組成的控制最小。此外，這些方法無法控制3D架構。

構建具有可控成分（包括細胞數量，細胞類型比率和3D形態）的球體的能力將代表其製造的重大進步。它不僅將提供用於研究和臨床使用的高質量球體，而且還可以自定義其屬性。例如，具有特定數量的不同細胞的球體對實驗條件或藥物的反應可能不同，而具有不同3D結構的球體可能更好地模仿它們打算建模的非球形組織。因為我們的方法是逐個細胞地構建結構，所以它提供了構建具有均勻大小，精確數量和類型的細胞以及受控3D架構的球體所需的控制。為了說明這些功能，我們對具有受控數目的起始細胞的球體進行生物列印（圖5a）。以相同數量的起始細胞（圖5b）印刷的球體之間具有顯著的均勻性，並且最終大小與初始細胞數緊密相關（圖5c，d）。的確，=印表機的單細胞性質允許用以前不可能的方式可靠地製造球體，包括從1個，5個和10個起始細胞。結果說明了使用逐個細胞組裝來構建具有新穎架構的球體的潛力。以前不可能對不同的起始條件進行球體組件的系統研究，因此，目前對球體如何影響最終結構的了解有限。因此，單細胞列印可用作生成受控球體的製造平臺，並用作測試床以研究如何通過控制初始細胞組成來設計其特性。

圖5 可控的球體列印

展望

單細胞印表機可以像流式細胞儀一樣用於分離斑點或孔的網格中的單細胞和多細胞組合。微米解析度可實現高密度列印，目前商業分選機不支持的格式，包括1536孔板，甚至密度更高的定製板。此外，這種受控分配應在單細胞多峰分析中提供新的機會，因為印刷細胞可以進行培養，成像，光譜學和基於陣列的單細胞測序。確實，流式細胞術中使用的技術應立即可用。例如，通過光散射，高光譜成像和實時成像進行細胞鑑定將無需預先標記即可進行鑑定。雖然這些方法在應用於未知人群時通常會失敗，但印表機使用了已知的懸浮液細胞類型，使用這些無標籤方法更容易實現準確識別。消除對螢光標記細胞的需求將簡化印刷工作流程，並在印刷結構的設計中提供更大的靈活性。

印表機為生物材料製造提供了獨特的機會。快速準確的單細胞列印可以組裝新穎的球體結構。通過包括顆粒和水凝膠基質，將可能形成具有包括空隙和功能性顆粒的受控結構的球體。橢球體已經是研究和藥物篩選中的寶貴工具，具有先進功能的可再現性構建它們的能力將使新的研究和應用成為可能。例如，受控組裝允許研究起始構型如何影響最終結構，這應該產生關於細胞如何協調產生多細胞結構的見解。同樣，印表機應與真核和原核細胞兼容。這些細胞的組裝應允許研究微生物如何協作以在各種環境中生存，鑑定可培養的細胞最少或研究生物膜和人類微生物組中的細胞相互作用。

研究者的方法的一個有趣的應用是原位細胞印刷，即將細胞或功能顆粒直接印刷到活組織上。小尺寸的列印頭可以實現這一點，從而可以將其插入受限的空間並列印到任何基材上。但是，到目前為止，關於此過程如何促進組織發育或癒合的研究很少，因為從未有過如此快速，準確和緊湊的單細胞印表機。因此，研究者的平臺在推進這一研究前沿方面應該是有用的。

參考文獻

Zhang, P., Abate, A. R., HighDefinition SingleCell Printing: CellbyCell Fabrication of Biological Structures. Adv. Mater. 2020, 2005346.

(https://doi.org/10.1002/adma.202005346)

文章引用於 https://mp.weixin.qq.com/s/ZEUrKCre_V7aLiI2Rhk8Bg

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