作者：俞維維 孫逸 顏浩 姚文武 樓秀玉 茅海燕 張嚴峻
發熱伴血小板減少症候群(severe fever with thrombocytopenia syndrome，SFTS)是2009年在我國湖北和河南山區發現的新發傳染病，臨床表現為發熱、血小板減少以及伴有消化道症狀，嚴重者可出現全身瀰漫性血管出血和多臟器功能損傷等症狀，平均死亡率約為5.3%[1,2]。現已證實其由發熱伴血小板減少症候群病毒感染所致，截止到2017年，至少有23個省市報導該病毒，其中18個省市已證實該病毒的傳播[3]。韓國、日本和美國等地也相繼報導發現有經蜱蟲叮咬傳播的類似SFTS病毒感染病例[4,5,6]。但目前並無針對該病毒的特效藥，而是以對症治療為主。
材料與方法
1.1 細胞和樣本
非洲綠猴腎細胞(Vero細胞)由浙江省疾病預防控制中心提供，3例SFTS病毒感染標本由浙江省疾病預防控制中心採集，分離血清於－80 ℃保存。
1.2 主要試劑與儀器
胎牛血清、MEM培養基：美國Gibco公司，
RNeasy Mini Kit：德國QIAgen公司，
AgPath-ID One-Step RT-PCR Kit：
美國Applied Biosystems公司，
SureSelect Strand-Specific RNA Library
Preparation試劑盒：美國Agilent公司，
RNA Seq Fragmentation Mix：美國Agilent公司，
AMPrure XP磁珠：美國Beckman Co μlter公司，
Agilent2100分析儀：美國Agilent公司，
Illumina Hiseq 4000：美國Illumina公司
1.3 核酸提取與檢測
病毒感染培養7 d後，用RNeasy Mini Kit標準方法提取總RNA。採用Real-Time螢光定量RT-PCR試劑盒AgPath-ID One-Step RT-PCR Kit，反應體系為25 μl，RNA為2 μl。經螢光定量RT-PCR檢測後的RNA用NanoDrop定量，根據結果，將RNA稀釋至5ng/ μl以下，使用Agilent2100(pico晶片)檢測RNA質量。
1.4 oligo(dT)磁珠抓取建庫
1.4.1 RNA抓取和片段化：
使用oligo(dT)磁珠抓取SFTS病毒的RNA。將捕獲到的RNA在高溫條件下利用二價陽離子進行片段化，加入RNA SeqFragmentation Mix後94 ℃孵育8 min後降溫至4 ℃，進行下一步cDNA合成。
1.4.2 DNA的合成：
將片段化的RNA加入RNA Seq First Strand Master Mix通過其中逆轉錄酶的作用合成為cDNA，同時加入放線菌素D，防止cDNA模板重新合成RNA。反應條件為：25 ℃ 10min，37 ℃ 40 min，降溫至4 ℃。用AMPrure XP磁珠進行純化後溶於20 μl水中，進行下一步二鏈合成反應。將一鏈與RNA的複合雙鏈轉化成DNA雙鏈，同時在二鏈中摻入DUTP，反應步驟為20 μl一鏈產物中加入25 μl RNA Seq Second Strand和End Repair Enzyme Mix，再加入5 μl RNA Seq Second Strand和End Repair Oligo Mix，總體積為50 μl，16 ℃ 30 min後降溫至4 ℃，用AMPrureXP磁珠進行純化後溶於20 μl水中，進行下一步的3′加A鹼基反應。
1.4.3 末端修飾：
在雙鏈DNA3′端加一個A鹼基，以方便進行接頭連接，反應步驟為在20 μl二鏈產物中加入20 μl RNA Seq dA Tailing Master Mix 37 ℃ 15 min後降溫至4 ℃，進行下一步接頭連接反應。利用雙鏈DNA3'端的A鹼基與接頭3′端的T鹼基進行連接，20 ℃ 15 min後降溫至4 ℃。用AMPrure XP磁珠進行純化和片段篩選，產物溶於17 μl水中，進行下一步擴增和純化反應。
1.5 隨機引物建庫
1.5.1 RNA片段化：
將RNA在高溫條件下利用二價陽離子進行片段化。94 ℃孵育4 min後降溫至4 ℃，進行下一步cDNA合成
1.5.2 雙鏈cDNA合成：
將片段化的RNA通過逆轉錄酶的作用合成cDNA。然後使用二鏈合成試劑，將這些DNA與RNA的複合雙鏈轉化成DNA雙鏈，同時對雙鏈DNA的末端進行補齊為平末端，利用磁珠對其進行純化。
1.5.3 末端dA-Tailing：
再在其兩端各加上一個A鹼基，使其能夠與末端帶有T鹼基的接頭進行連接，再利用磁珠對其片段大小進行篩選和純化。
1.5.4 PCR擴增與純化：
PCR擴增形成片段大小為300 bp (±50 bp)的文庫，用磁珠對產物進行純化。
1.6 Illumina測序
使用Illumina Hiseq 4000，按照標準操作對其進行雙端測序。Illumina測序得到的原始圖像數據經過Base Calling轉化為序列數據，結果以FASTQ文件格式來存儲。並將原始數據進行預處理，去除測序reads中的接頭序列，進行窗口法質量掃描，掃描窗口默認為6 bp,當窗口內平均質量值低於20時，將reads從窗口起始到3′終止的部分截掉。再去除截短後長度小於100 bp的序列和N的含量在5%以上的序列。
1.7 數據分析
對有效數據進行分析，以NCBI(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov)上HB29/China/2010為標準株的L、M、S序列分別作為參考基因組序列，將有效數據與參考基因組序列採用bwa-v0.7.10軟體進行比對，用MEGA軟體對3株病毒全基因組核苷酸序列與GenBank中已知的SFTS病毒核苷酸序列進行分析，並構建系統進化樹。
結 果
2.1 核酸提取與分析
經檢測，3例樣本的提取的核酸濃度、純度、質量如表1。採用Agilent2100生物分析儀分析核酸，未見明顯18S和28S RNA。
表13份標本的病毒RNA濃度、純度和質量檢測結果
Tab.1Concentration, purity and quality of virus RNA from threesamples
2.2 建庫結果
分別利用隨機引物建庫和oligo(dT)磁珠抓取建庫的方法對3株病毒進行測序比較。採用Agilent 2100生物分析儀分析文庫，結果見圖1。3例樣品測序讀取片段數、讀取鹼基數、有效數據率、測序深度、覆蓋度和Q30%總結統計於表2。
圖1兩種方法擴增文庫毛細管電泳結果
Fig.1Electrophoresis assay for libraries of the two methods
表2兩種方法建庫測序獲得的數據結果
Tab.2Sequencing data of the two methods
2.3 測序結果
對採用oligo(dT)磁珠抓取建庫法的3株病毒測序結果進行剪輯和拼接，獲得標本的全基因組序列，表2。與NCBI上HB29株的L，M，S三條序列進行比對，其中S片段相似度分別為94.8%、94.1%和94.5%；M片段相似度分別為93.8%、92.9%、93.2%；L片段相似度分別為95.8%、95.7%和95.4%。
GenBank獲得的SFTS病毒基於S、M和L片段的分子系統進化樹：3株病毒與浙江、日本和韓國分離株在同一分支，SFTSV-1、SFTSV-2和SFTSV-3分別於與Zhejiang/ZHSH-WRF/2014、Zhejiang/DS04/2013和Zhejiang/DS03/2013進化關係最近。但SFTSV-2與Zhejiang/DS04/2013在M片段進化關係較遠(圖2)。
圖2GenBank獲得的SFTS病毒基於S、M和L片段分子系統進化樹
Fig.2Phylogenetic trees of SFTS virus S, M and L genomic segmentsbased on GenBank databases
討 論
SFTS病毒是一種新發病毒，它的分子特徵目前還沒有完全闡明，對病毒全基因組的高效測序並進行不同基因組序列之間的比對分析，有助於了解病毒的遺傳進化、功能表位和突變位點等[10]。傳統的一代測序耗時長，通量低且對未知病毒的檢測較為局限，近年來，高通量測序已廣泛應用於以轉錄組測序等為代表的功能基因組學研究中[11,12]。對於有參考基因組序列的物種，轉錄組測序數據可以大大豐富和驗證對基因組數據的注釋[13]。其中Illumina平臺測序技術輸出序列長度短，通量大，速度快，被廣泛應用於核酸檢測研究。
本文首先對3株SFTS病毒採用同樣的方法分離並提取RNA，要求RNA質量大於300ng，260/280和260/230在1.8以上。經Agilent2100分析儀分析，3株病毒提取的RNA含有少量的18S和28SRNA，可能是rRNA、tRNA和mRNA等宿主RNA，隨機引物建庫的方法可能會使後續獲得的數據含有宿主序列[14]。目前，樣品RNA的提取與處理仍是研究的關鍵技術瓶頸，有研究人員通過設計特異性雜交探針，建立基於磁性微球的特異性富集純化SFTS病毒基因組的方法，但也存在新病毒或變異較大的病毒難以被探針捕捉而被遺漏的缺陷[15,16]。利用oligo(dT)磁珠抓取病毒RNA的方法可以選擇性抓取末端含有多個A鹼基的SFTS病毒的RNA，而少量的宿主mRNA不穩定，易分解，從而達到富集病毒RNA的目的[17,18]。
本研究對3株病毒分別採用了隨機引物和oligo(dT)磁珠抓取建庫的方法，後者針對SFTS病毒基因組5′末端含有多個A鹼基，利用帶有寡聚胸腺嘧啶的oligo(dT)磁珠進行抓取建庫[17,18]，擴增了病毒核酸序列。結果發現，oligo(dT)磁珠抓取建庫法讀取的鹼基數、測序深度和覆蓋度明顯高於隨機引物建庫法(表2)。通過oligo(dT)磁珠抓取建庫法測序，測序深度都在900×以上，覆蓋度均超過99%。獲得的3株病毒序列與參考株三條序列比對率均達到了90%以上。結果證明，oligo(dT)磁珠抓取建庫法可選擇性去除無關的RNA，如rRNA，tRNA或組蛋白mRNA，提高建庫的特異性[19]，而隨機引物建庫法失敗可能是提取核酸時宿主核酸汙染造成。
通過系統進化發行，發現3株病毒與日本、韓國、浙江株屬於同一分支，且3株病毒均來自浙江舟山市。根據報導，蜱可將SFTS病毒以及一些蜱傳播病毒傳播給其他動物，包括陸地鳥類和海鳥[20]。中國、韓國和日本緯度接近，有許多島嶼，為遷徙海鳥提供了棲息地，攜帶蜱蟲的海鳥可以作為傳播SFTS病毒的間接載體，因此推測這3株病毒可能存在跨洋傳播[10]。其中SFTSV-2病毒與Zhejiang/DS04/2013株的S與L片段在進化關係上最近，但M片段進化關係較遠，該片段可能存在變異。
綜上所述，本研究建立了一種針對SFTS病毒的耗時短、特異性高、經濟有效的高通量測序建庫方法，為研究SFTS病毒基因組遺傳變異以及同源性提供了技術支持。
選自中華實驗和臨床病毒學雜誌, 2019,33(1)
來源：檢驗科空間 / 編輯：Yang