染色體微陣列分析在產前診斷中的應用



染色體微陣列分析(chromosomal microarray analysis，CMA)技術是一項高解析度的全基因組篩查技術，可以檢出大多數通過傳統核型分析可以檢出的染色體不平衡性改變，以及那些被稱之為拷貝數變異(copy numbervariants，CNV)的微小缺失和重複。CNV可導致很多人類疾病，包括神經發育性疾病以及先天性異常，如先天性心臟病。CMA是先天性異常和神經發育性疾病產後診斷的一線檢測技術，並被證明在產前診斷中也是一項有價值的診斷技術。CMA可用於未經培養的DNA樣本，包括從CVS和羊膜腔穿刺術中獲得樣本，因此較核型分析的檢驗周期更快。

微陣列分析有哪些不同的技術類型？

        在產前診斷中應用的微陣列平臺主要有兩種：單核苷酸多態性(single-nucleotidepolymorphism，SNP)陣列和比較基因組雜交(comparativegenomic hybridization，CGH)陣列。

        標準的核型分析可以檢出非整倍體、相對較大的染色體結構異常(5-10Mb以上的缺失和重複)、平衡性的易位和倒位。CMA比傳統核型分析的解析度高，可以檢出低至50-100kb的缺失和重複。CMA也可以檢出在核型分析中貌似平衡的重排的斷裂點附近的CNV。

        有一些大型的研究比較了CMA與傳統核型分析在產前診斷中的應用。2012年美國國家兒童健康和人類發育研究所(NICHD)證明了對於異常超聲表現者，CMA是最好的診斷技術。對於超聲異常而染色體核型正常的胎兒，CMA在6%的病例中檢出與臨床相關的缺失和重複。對於超聲結構正常、由於單純高齡或非整倍篩查陽性而接受CVS或羊膜腔穿刺術的孕婦，CMA在1.7%的病例中檢出與臨床相關的缺失或重複。對4項大型研究(包括NICHD的研究)的系統回顧發現，在超聲異常的病例中CMA的檢出率達6.5%(201/3090)，在高齡孕婦中達1.0%(50/5108)，在其他行CVS或羊膜腔穿刺的人群中(如父母焦慮、血清學篩查陽性、染色體異常兒分娩史)可達1.1%(44/4164)。所有這些病例的核型分析均正常。

        CMA相對於傳統核型分析的另一個優勢是這項技術不需要分裂細胞，這可以使得檢驗周期大大縮短。CMA也可用於獲自死產標本的石蠟包埋組織，因此，只要能獲得足夠量的高質量DNA，CMA就可以獲得結果。來自死產合作研究網絡(Stillbirth Collaborative ResearchNetwork)的基於人群的532例死產病例的結果顯示，CMA較標準核型分析更易獲得結果(87.4% vs 70.5%，p<0.0001)，從而提高對遺傳學異常的檢出率(8.3% vs 5.8%，p=0.0067)。

        由於CMA所尋找的是不平衡性改變，因此對於完全性平衡性的染色體重排，該技術是無法檢出的，但是絕大多數的平衡性重排的表型都正常。另外，CMA無法提供基因不平衡性改變的染色體機制。例如，如果有一條完整的13號染色體的重複，CMA並不能鑑別是13三體還是不平衡性羅氏易位所致，後者需要進行有關再發風險的諮詢。因此，對於那些需要除外可能會遺傳的易位等病例還是需要進行核型分析的。CMA也不能檢出低水平嵌合，有些微陣列技術不能檢出三倍體。CMA也不能檢出所有的CNV，比如那些不出現在檢測平臺上的區域，以及低於檢測水平的小CNV。在有些情況下，產後CMA可以檢出的CNV無法在產前被檢出，因為產後CMA平臺的解析度要比產前CMA平臺的要高。另外，CMA也無法檢出局限於單個基因的點突變，包括那些可以致病的點突變，如鐮形細胞性貧血、囊性纖維化，以及很多骨骼發育不良性疾病。

        CMA的缺點之一是無法準確解釋以往未報到過的CNV的臨床意義，或無法準確預測那些和一些不同結局均有相關性的CNV的表型。CNV被分為良性、有臨床意義(病理性)、臨床意義不明確的(variant ofuncertain significance，VUS)這三類。VUS的總體發生率約為1-2%。由NICHD發起的多中心試驗報導，在核型正常的病例中，病理性CNV的發生率為0.9%，VUS的發生率為1.5%。

        如果有必要應提供進一步的檢測。評估的第一步就是要明確父母一方是否具有和胎兒中所檢測到一樣的VUS。儘管新生的CNV更可能是病理性的，但即使父母與胎兒擁有同樣的CNV也不總能排除胎兒異常的可能性。當我們解釋VUS的時候，對包含有缺失或重複區域的特異基因進行評估是有幫助的。總體而言，相對於小的缺失而言，小的重複具有臨床意義的可能性較小。

        ACOG和SMFM都推薦「應向所有孕婦通過篩查或診斷性試驗的方式提供胎兒非整倍體的評估，不管孕婦的年齡大小以及有無其他高危因素……應討論篩查試驗和診斷性試驗之間的區別。」特別是當存在胎兒結構異常和/或胎兒死亡而需要進行遺傳學分析時，尤其應推薦進行CMA檢測，在這些情況下，CMA已取代了核型分析。ACOG和SMFM推薦對於胎兒結構正常的而又接受介入性產前診斷的孕婦可以進行核型分析或CMA檢測，無論孕婦的年齡大小。

        目前，有些學者推薦將CMA列為胎兒染色體檢測的一線方案，有些學者則推薦僅將CMA應用於胎兒結構異常的病例以減少發現VUS的可能性。NICHD研究中發現，在超聲結構正常且核型正常的胎兒通過CMA檢出的有臨床意義的異常的發生率為1.7%(1/60)。綜合5個產前CMA研究的數據，在因為孕婦高齡而進行介入性產前診斷的3151例病例中，CMA檢出傳統核型分析所無法檢出的異常率為0.5%。

        如果核型分析發現了新生的貌似平衡性的染色體重排，則應考慮行進一步的CMA檢測以除外在重排斷裂點處的不平衡改變。一項納入了239例產前核型分析提示平衡性重排的研究中，CMA發現在7.9%的病例中存在斷裂點處的缺失或重複。對於明確標記染色體或環狀染色體的染色體來源和基因內容方面，CMA也能提供有益的信息。

什麼情況下只行核型分析即可？

        如果產前超聲檢查強烈提示胎兒罹患常見染色體非整倍體，如21、13、18三體或X單體時，則採用傳統核型分析和/或快速FISH分析即可，這可以提供更快的檢測周期，對於低水平嵌合以及除外易位性三體更加敏感有效。如果傳統核型分析或FISH結果正常則應考慮CMA檢測。對於那些有復發性流產史的夫婦採用傳統核型分析以檢出潛在性的平衡易位是最合適的一線方案。

        有些情況下在獲得異常CMA結果之後應行核型分析。如果CMA提示近端著絲粒染色體(13,14,15,21,22)三體時，應行核型分析以除外不平衡性羅氏易位。根據片段大小，推薦採用FISH或核型分析以除外涉及更小CNV的遺傳性重排，這將為再次妊娠提供再發風險的準確信息。

如何對病人進行

我們推薦應由經過訓練的遺傳諮詢師、遺傳學家、或其他專家在提供檢測者應熟悉其實驗室所採用的微陣列平臺，包括VUS率。應告知病人，與傳統核型分析相比，對於超聲結構異常的病例CMA可以檢出額外的6-7%的病理性CNV，對於超聲結果正常的病例，CMA可以檢出額外的1-1.7%的病理性CNV。VUS的發生率為1.4-2.1%。檢測前諮詢應包括對CMA能夠檢測到的疾病譜的討論，包括嚴重的神經系統異常以及一些較輕的成人期發病的疾病。應告知病人CMA不能檢出所有的遺傳性疾病或症候群，包括與單個基因點突變相關的常染色體隱性疾病。CMA也可能會發現近親關係以及非父源性關係。

應採用什麼樣的標本？

        可以採用提取自羊膜腔穿刺術、CVS、臍血、死產標本的DNA來進行CMA檢測，更傾向於採用提取自絨毛間充質細胞和未培養羊水細胞的DNA來進行CMA檢測，這可以縮短檢驗周期並避免培養假象的可能性。有些實驗室要求同時提供母血標本，有些實驗室要求同時提供雙親標本，以鑑別所檢測到的CNV是遺傳性的還是新發生的。

產前和產後

        在產後診斷的情況下，CMA是用來解釋已經存在的異常的原因，而在產前診斷的情況下，CMA是為了預測胎兒的結局。在很多產前診斷的病例中，很多病人選擇進行CMA時為了確認沒有有意義的發現。CMA被推薦對罹患多發性先天性異常、發育遲緩/智力障礙、和/或自閉症譜系疾病的病人進行評估的一線方案，在核型正常的情況下，CMA能夠檢出有臨床意義的CNV的機率為15%。在產後診斷的情況下，明確診斷在很多方面對於父母而言都很重要，其中包括對尋求診斷的過程的終止，獲取有關資源，未來對孩子怎樣護理，以及對於再次妊娠的指導。發現一個有臨床意義的CNV可以抵消發現VUS的負面影響。在產前診斷的情況下，尤其是對於超聲結構正常的病例，VUS可能會帶來相當的壓力和焦慮，父母可能會因此選擇終止妊娠。要想解釋一個產前發現的CNV的意義會很困難，源於胎兒影像學發現的局限性，以及目前對於產前CNV發現和產後可能的表型之間的關係方面的信息非常有限。

        為了減少發現VUS的可能性，很多專家提倡在產前診斷中採用靶向CMA而不是全基因組CMA。靶向CMA採用主要用於檢出臨床意義非常明確的CNV的平臺，包括三體，或已被詳細闡述的微缺失/微重複症候群。但是，靶向微陣列也會導致診斷產出降低的問題。在過去幾年中靶向微陣列的探針密度已經增加，對CNV分類的知識也在增長，全基因組微陣列和靶向微陣列之間的差別也在日趨縮小。如前所述，產後CMA的解析度要比產前CMA的更高，因此在有些情況下會檢出產前CMA未能檢出的CNV來。

其他協會有哪些有關

        最近來自國際上和國內的其他協會的指南都提倡將CMA應用於產前診斷中。ACOG和SMFM在2013年發表了關於微陣列技術在產前診斷中應用的聯合推薦意見，推薦將CMA應用於胎兒結構異常和/或死產的遺傳學分析，並推薦在這些情況下以CMA取代核型分析。對於胎兒結構正常者，採用核型分析或CMA分析均可。全面的檢測前和檢測後諮詢，以及知情同意都是必須的。儘管ACMG發表了針對臨床實驗室的指南，但組織者卻沒有發表針對臨床醫生的有關微陣列在產前診斷中應用的指南。

        加拿大婦產科醫師協會和加拿大醫學遺傳學家協會申明，不推薦對於染色體結構異常低風險的妊娠進行CMA檢測，但可將CMA作為超聲或MRI發現胎兒結構異常病例的產前診斷性試驗。

        英國醫學遺傳學聯合委員會的一個工作小組在2015年6月推薦對於下列一項或多項胎兒結構異常者進行CMA檢測，包括孤立性的≥3.5mm的NT，核型分析提示性染色體非整倍體卻不能以此來解釋的超聲異常。義大利人類遺傳學協會2012年的申明提出，CMA僅可用於胎兒結構異常的遺傳學分析的二線方案，作為對產前標準核型分析的補充，而不是取而代之，以及對於新發生的染色體重排和標記染色體的分析，以明確其染色體來源和基因成分。

CMA檢測前諮詢的示範樣本

應在行產前CMA檢測前告知病人：「CMA是一項比常規核型分析或染色體分析更精細的遺傳學檢測，通過這項檢測可以發現常規核型分析無法發現的異常。但是，有時候會發現一些臨床意義不明確的小的異常，這可能會，也可能不會提示胎兒有問題。」

另外，檢測前諮詢還應包括：

† CMA可以發現大多數核型分析能夠檢出的有意義的異常以及很多其他的遺傳性疾病，但不能檢出所有的遺傳性疾病。

† 所檢出的疾病的臨床表現可能差異很大，從輕度到嚴重不等。對於一個既定的病人，不可能預測其結局。

† CMA可能會揭示近親或非父源關係。

† 所發現的遺傳學改變可能會，也可能不會導致疾病的發生。有時需要獲取父母雙方的樣本來幫助對結果的臨床意義進行解釋。

† 結果可能會揭示成人期發病的疾病，該疾病並不影響新生兒期或兒童期時的健康，但在以後的生命中其嚴重性尚未知。出現這樣的結果也提示雙親之一也罹患同樣的成人期發病的疾病但尚未出現症狀。

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