聲明：本文發表於《中華圍產醫學雜誌》2012年第12期760-765頁。轉載請註明出處，違者《中華圍產醫學雜誌》將依法追責。
微陣列比較基因組雜交技術在產前診斷中的應用研究進展
符芳 廖燦
作者單位: 510623 廣州市婦女兒童醫療中心優生圍產研究所
出生缺陷約佔新生兒總數的3%,出生缺陷的原因有遺傳學因素、環境因素或者是兩者共同作用。在高風險胎兒中,常規染色體核型分析異常檢出率為2%~3%。而在產前超聲檢查提示結構發育異常的胎兒中,常規染色體核型分析異常檢出率高達35%[1-3]。傳統的G顯帶染色體核型分析技術通過對羊水、絨毛及臍血細胞進行分析,能夠檢出所有的非整倍體異常和較大的染色體結構異常,但不能檢出<10 Mb的染色體結構異常[4]。螢光原位雜交(fluorescence in-situ hybridization,FISH)技術除了可以快速分析染色體數目異常外,還能夠在中期細胞檢測染色體的缺失或重複,以及判斷標記染色體(supernumerary marker chromosomes,SMCs)的來源。然而,FISH 技術要以已知的核型結果為基礎。如今,絕大多數的產前診斷實驗室都選擇螢光定量聚合酶鏈反應(quantitative fluorescent-polymerase chain reaction,QF-PCR)或者多重連接依賴探針擴增(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)技術快速檢測常見的染色體三倍體,因為這些技術不需要經過細胞培養[5],成本較低。但是,QF-PCR 或者MLPA 技術不能檢測染色體結構異常。
在臨床實踐中,有相當大一部分超聲提示結構異常的胎兒不能得到明確的產前診斷,這是因為傳統的染色體分析方法無法識別這些異常,而認為這些異常胎兒的核型是「正常」。事實上,這些異常胎兒中很大一部分的基因組發生了細微的不平衡畸變,其中細小的缺失和重複是最常見的類型。微陣列比較基因組雜交(array-based comparative genomic hybridization,array-CGH)技術的發展和應用在很大程度上使上述問題得到解決。
一、array-CGH 技術的發展
array-CGH 技術是在其前身——比較基因組雜交(comparative genomic hybridization,CGH)技術的基礎上發展延伸而來。Wessendorf等[6]在2002年將CGH 技術與晶片技術相結合,形成了真正的array-CGH 技術。array-CGH 技術克服了傳統的染色體核型分析技術的局限性,具有高通量、高解析度、快速的優點,一次實驗即可檢測待測樣本整個基因組拷貝數的變化。其基本原理是將等量的經過不同螢光標記(或生物素標記)的待測DNA 和標準參照DNA 同時雜交到分布有標準人類全基因組寡核苷酸探針的微陣列上,經配套掃描儀掃描,計算機軟體分析,將待測DNA 和對照DNA 信號強度進行計算機換算處理,以研究待測樣本基因組拷貝數的變化。該技術不僅解析度高(可精確到50 bp),而且不需要製備中期染色體,只需要少量DNA,耗時僅72 h。array-CGH 技術能夠可靠地檢測出所有由染色體微缺失或微重複引起的基因組不平衡改變,並且可精確定位,清楚顯示異常片段內的基因含量,因此能夠快速發現、鑑定疾病相關基因。
array-CGH 技術自從出現以來,主要被用於腫瘤的全染色體組分析,在其他遺傳病方面的研究鮮有報導,2007年幾位研究者應用array-CGH 技術對不明原因智力低下和先天性異常患者進行診斷之後[7-9],人們開始真正討論array-CGH 技術是否也可以用於檢測從羊水或者絨毛中提取的DNA[10-11]。到目前為止,應用array-CGH 技術對出生缺陷患者進行檢測能夠檢出的已知微缺失/微重複症候群已經超過400種,新的症候群還在不斷地被發現。
二、array-CGH 技術在產前診斷中的應用
1.回顧性研究:在產前診斷方面,最開始的報導是應用array-CGH 技術對顯微鏡下看到的不平衡染色體異常進行驗證分析。2006年,Rickman等[12]首次成功應用2種以細菌人工染色體(bacterial artificial chromosomes,BAC)為探針的晶片技術,對30例已知不平衡染色體異常、未經培養的羊水細胞進行分析,這2種晶片的解析度都為1Mb,結果檢出29例不平衡染色體異位,另外1例不能檢出的核型是三倍體。該研究認為,array-CGH 是一種快速並且較低勞動密集型的技術,由於具有高解析度、高通量並且易於自動化操作的特點,在檢測非整倍體方面可以替代傳統染色體核型分析[13]。Bi等[14]應用寡核苷酸探針的晶片對從新鮮羊水中提取的15例DNA 樣本進行分析,其中2例樣本的DNA 量極少,研究結果證明了寡核苷酸晶片的臨床實用性。由於array-CGH 技術可能會檢出不明臨床意義的拷貝數變異(copynumber variations,CNVs),因此array-CGH 技術最初只是被應用於產前診斷中的回顧性研究,即在超聲提示結構異常的胎兒引產之後再進行分析,以驗證超聲檢查的結果[15]。
為了分析array-CGH 技術的檢測效率,LeCaignec等[16]應用商業化的BAC、P1衍生人工染色體(P1-derivedartificialchromsomes,PAC)探針晶片對石蠟包埋的胎兒組織進行分析,這些胎兒都是發生3處或以上多發畸形,且常規核型分析結果正常。array-CGH 結果在排除遺傳自親代的不平衡異常和多態性改變後,發現致病性不平衡改變佔8%(4/49)。Tyreman 等[17] 應用單核苷酸多態性(sing le nucleotide polymorphism,SNP)晶片對106例隨機挑選的超聲結構異常但染色體核型正常的樣本進行研究,結果識別35例CNVs,其中9%的CNVs是致病性的。同時,該研究中有1例三倍體的樣本同樣能夠被SNP晶片檢測出來。另外一項回顧性研究應用寡核苷酸晶片對50例多發畸形但常規核型分析結果正常的胎兒進行研究,結果發現致病性CNVs佔10%[18]。array-CGH 技術的檢出率在指徵不同的樣本和不同人群中具有明顯的不同。Faas等[19]應用250kSNP晶片對32例超聲提示多發畸形但常規核型分析結果正常的產前診斷病例進行分析,致病性CNVs檢出率為16%。在所報導的回顧性研究中,應用SNP 晶片能夠檢測出單親二倍體(uniparental disomy,UPD),即分別為父源性UPD4 和母源性UPD16。這些結果說明SNP晶片具有能夠檢測UPD的優勢。
2.前瞻性研究:在產前診斷前瞻性研究方面,最早報導的是Sahoo等[20]的研究。該研究在胎兒具有染色體異常高風險的98例孕婦中,同時採用全基因組array-CGH 技術和傳統核型分析技術進行分析,其中74% 的夫婦願意接受array-CGH 技術檢測。應用全基因組array-CGH 技術分析的產前診斷樣本,從新鮮羊水中提取的DNA 都經過基因組的擴增,從絨毛中提取的DNA 視質量情況根據需要進行基因組擴增,從培養的羊水中提取的DNA 不用進行基因組擴增。研究結果提示,array-CGH 技術檢出的結果與常規核型分析結果完全吻合,但array-CGH 技術不能識別其中1例羅伯遜平衡易位[20]。在另外一項前瞻性研究中,Shaffer等[21]應用靶向晶片對151例產前診斷樣本進行分析,這些靶向探針僅覆蓋重大的染色體異常區域,重大遺傳病的檢出率為1.3%。在該研究中,最常見的產前診斷指徵是胎兒超聲結構異常(73%),其他的指徵主要是夫婦焦慮(13.2%)和家族史(12.6%)。在應用array-CGH 技術檢出的結果中,有0.6% 的病例檢出不明臨床意義的CNVs。在另外一項前瞻性研究中,VandenVeyver等[22]同樣應用靶向晶片對300例產前診斷樣本進行分析,研究結果表明重大遺傳病的檢出率為1.4%,不明臨床意義的CNVs 檢出率為1%。然而,Coppinger等[23]在另外一項研究中,應用全基因組晶片對182例產前診斷樣本進行分析,致病性CNVs的檢出率提高到2.7%,而不明臨床意義的CNVs的檢出率與靶向晶片水平一樣,並未增加。由此可見,不明臨床意義的CNVs的檢出與晶片探針的覆蓋範圍沒有密切關係。
2009年11月,美國遺傳學協會(American Committeeon Genetics)發布了關於array-CGH 技術在產前診斷中應用的公告[24],推薦傳統的染色體核型分析技術仍然是產前診斷的主要方法,提倡使用靶向晶片進行檢測,強調在應用array-CGH 技術檢測之後要特別注意產前和產後的遺傳諮詢。在考慮把array-CGH 技術作為常規的產前診斷方法之前,首先進行大規模的人群篩查研究是很必要的。
最能夠體現array-CGH 技術在產前診斷中的應用價值的是應用array-CGH 技術對超聲發現結構異常但常規核型分析結果正常的產前診斷樣本進行分析。因為在現有的研究報導中,這部分研究對象雖然數量比較少,入選的指徵標準也不同,但array-CGH 技術檢出的重大致病性結果都很明顯。無論產前診斷指徵是什麼,在常規核型分析結果提示正常的樣本中,array-CGH 技術能夠額外檢出3.6%的遺傳病,如果產前診斷指徵是胎兒超聲結構異常,那麼檢出率將提高到5.2%[25]。一個加拿大的研究團隊報導,應用全基因組晶片
對48例多發畸形但染色體核型分析結果正常的胎兒進行研究,重大遺傳病的檢出率是8.2%[26],而不明臨床意義的CNVs的檢出率同樣高達12.2%,原因是未對父母樣本進行分析。
最近有研究應用44k的寡核苷酸晶片,探針主要覆蓋已知的微缺失症候群位點、端粒區以及圍著絲粒區的位點,在48 例頸項透明層(nuchal translucency,NT)增厚(>3.5 mm)的胎兒樣本中檢出的致病性CNVs佔8.3%,其中2例胎兒合併超聲掃描無法識別的結構異常[27]。另外一種能夠顯示array-CGH 技術巨大價值的產前診斷指徵是胎死宮內。因為在這些樣本中,胎兒細胞培養的失敗率高達30%,而array-CGH 技術檢測的成功率是98%,重大遺傳病檢出率是9.8%[28-29]。
2010年,由國際標準細胞遺傳學聯盟發起的針對全球所有應用array-CGH 技術對臨床遺傳病患者研究的文獻報導進行的綜述得出結論:在原發性智力低下和先天性異常患者中,array-CGH 技術的檢出率為15%~20%,而標準的染色體核型分析技術檢出率只有3%。因此,強烈推薦把array-CGH 技術作為原發性智力低下、先天性發育異常以及孤獨症患者的臨床一線診斷方法[30]。基於此,2010年加拿大遺傳協會(CanadianCollegeofMedicalGeneticists)發布了相關指南,規定array-CGH 技術可以作為對上述臨床指徵患者的臨床一線診斷方法,對超聲發現的胎兒結構異常、常規方法發現的新發平衡易位以及具有高危家族史的產前診斷樣本進行產前診斷[31]。雖然如此,array-CGH 技術是否能取代傳統的核型分析方法應用於產前診斷一直存在爭議[32]。
三、array-CGH 技術與傳統核型分析方法比較
1.array-CGH 與標準染色體核型分析技術比較:與傳統G顯帶染色體核型分析相比,array-CGH 技術屬於低勞動密集型技術,無需經過細胞培養製備中期染色體,並且所需樣本量極少。另外,array-CGH 技術的顯著優勢是能夠檢測顯微鏡下無法識別的細小缺失和重複,檢出率的高低與晶片上探針的覆蓋密度密切相關。絕大多數的研究報導均主要強調全基因組array-CGH 技術對微缺失和重複有較高的檢出率,但關於array-CGH 技術在產前診斷應用過程對染色體平衡易位、多倍體、嵌合體、UPD 以及SMCs等的檢測情況較少提
及。具體見表1(略)。
2.array-CGH 技術與標準染色體核型分析方法的遺傳諮詢比較:對於臨床遺傳諮詢來說,遺傳諮詢師對array-CGH 技術產前診斷結果的解釋經驗遠遠落後於對傳統核型分析結果的解釋經驗。在臨床實踐中,超聲提示結構異常的胎兒,可能患有某種已知的染色體病,臨床醫生對於此方面的遺傳諮詢已經積累了豐富的經驗[50]。然而,對於array-CGH 技術可能檢測出來的某種異常或者是複雜染色體異常,其臨床意義卻是不能預知的[51]。這種未知的情況使得在遺傳諮詢中無法準確進行侵入性操作手術的風險-利益評估。另外,幾乎所有由傳統核型分析方法檢測得到的染色體結果其臨床意義都是已知的,然而隨著晶片解析度的不斷提高,array-CGH 技術所產生的不明臨床意義CNVs結果也在增加,從而增加了患者的焦慮,甚至有可能基於不確定性結果而終止妊娠。為了能夠準確判斷和解釋array-CGH 技術的結果,在產前診斷中必須同時對胎兒的生物學父母樣本進行分析,如果未能對父母之一進行分析,則不確定性結果的檢出風險將會增加,但對胎兒及其父母進行array-CGH 技術的檢測並不能檢出單基因遺傳病。所以,對於從事遺傳諮詢工作的人員來說,熟悉每項技術本身的局限性及其伴隨的風險必不可少。
四、array-CGH 技術在未來產前診斷中的應用展望
近年的研究表明,通過對孕婦血漿中游離胎兒DNA 進行分析,能夠可靠地對21、13、18-三體進行診斷[52]。在過去,人們也曾經努力嘗試分離孕婦外周血中的胎兒細胞[53-55],然而成功的並不多。雖然這些胎兒細胞確實是獲取胎兒遺傳物質的一個純正來源,得到這些細胞之後只需要應用最簡單的技術方法,例如FISH 就能快速做出診斷,但是分離胎兒細胞的過程被證明是有問題的,且耗時費力[56]。因此,目前的研究都聚焦在胎兒游離DNA 或者RNA。Lo等[57]首次報導孕婦血漿中存在胎兒游離DNA。當無創性產前診斷技術發展成熟時,相信會有更多的孕婦選擇接受產前診斷,尤其是唐氏症候群高危人群將顯著受益於無創性產前診斷的發展。另外一個能夠得到飛速發展的是妊娠早期唐氏症候群胎兒的篩查,目前的篩查方案假陽性率仍然較高,未來將直接進行診斷,而不是篩查。應用潛在的生物標記,例如胎盤來源的多肽,將可以進行妊娠中期的無創性產前診斷。經過這序貫檢測之後,只有極少數的唐氏症候群高危孕婦需要接受侵入性的產前診斷[56]。未來可能的產前診斷操作流程總結如圖1。
圖1 未來產前診斷可能的操作流程圖
在今後的產前診斷中,遺傳諮詢師應當充分評估胎兒的指徵,為患者推薦恰當的技術。例如,在高齡或者唐氏症候群高風險的人群,只用快速簡單的方法就可以滿足診斷,因為這部分胎兒群體發生基因組微小不平衡改變的概率比較低[58]。另一方面,對於超聲發現胎兒結構異常的孕婦,以及曾生育過染色體異常患兒或具有家族史的孕婦,推薦選用高解析度的array-CGH 技術進行分析。相信在未來幾年裡,無創性產前診斷技術將會在臨床發揮極其顯著的優勢。這些無創性檢測方法將會涵蓋DNA、RNA 或蛋白質的方面。在未來產前診斷中,array-CGH 技術有可能會被正在蓬勃發展起來的高通量測序技術所取代。一旦高通量測序技術應用於產後遺傳病患者的檢測時,那麼也就意味著應用於產前診斷的時機來臨了。應用高通量測序技術,可直接檢測全基因組的核苷酸序列,基因組不平衡異常的檢出率將會進一步提高。然而,與此同時,臨床不確定性結果的檢出率也將會大大增加。因此,當這些技術應用於產前診斷的時候,深度熟悉基因組學和生物信息學知識將會是對臨床遺傳諮詢師的強制性要求。
總之,隨著array-CGH 技術和其他更新穎的技術不斷應用於產前診斷,給產前診斷領域帶來了巨大的挑戰,面對這些檢測結果,胎兒個體應該得到理想的產前護理,而不是亮起生命的紅燈[59]。這主要體現在嚴格管理和實施這些產前檢測技術,並且提供足夠充分的檢測前和檢測後的遺傳諮詢。在array-CGH 技術、高通量測序技術以及其他新技術應用於產前診斷的新時代,遺傳諮詢師在與孕婦及家屬解釋和溝通時,需要具備比以往任何時候都要豐富得多的知識和技巧。
參考文獻(略)