高齡孕婦胎兒基因組拷貝數變異發生率研究_高齡孕婦_拷貝數變異_高...

高齡孕婦胎兒基因組拷貝數變異發生率研究

2020-11-13 來源：中國實用婦科與產科雜誌

作者：王洪玲，王穎，劉璐瑤，李淑媛，哈爾濱醫科大學附屬第一醫院

摘要：目的   探討應用基因組拷貝數變異測序（CNV-seq）技術檢測高齡孕婦羊水中基因組拷貝數變異（CNV）的發生率。方法    收集2018年1月1日至12月31日因年齡高風險在哈爾濱醫科大學附屬第一醫院應用羊膜腔穿刺術進行產前診斷的孕婦羊水標本247例。對胎兒羊水細胞進行G顯帶染色體核型分析的同時應用CNV-seq檢測羊水細胞基因組DNA，統計在羊水染色體核型分析正常的高齡孕婦中CNV的發生率。結果    247例羊水標本中，染色體核型分析和CNV-seq同時檢測出染色體非整倍體共計21例，其中21-三體症候群14例，18-三體症候群2例，13-三體症候群1例，性染色體非整倍體4例。染色體核型分析檢出性染色體非整倍體1例（為45，XO［3］/46，XX［97］）；染色體結構異常9例，其中染色體易位4例，染色體正常變異3例，2例染色體結構異常經CNV-seq檢測最終確定異常片段的來源。染色體核型異常總檢出率為12.55%（31/247）。在216例染色體核型結果正常的羊水標本中，CNV-seq額外檢出明確致病CNV 4例，臨床意義未明的染色體微缺失6例（其中1例為父源，1例為母源，其餘4例未進行夫婦驗證），CNV多態性15例。羊水樣本中CNV的總檢出率為19.43%（48/247），CNV-seq比染色體核型分析額外增加了6.88%的檢出率，其中明確致病的CNV檢出率為1.62%（4/247）。結論    對進行有創產前診斷的高齡孕婦，在排除了常見的非整倍體異常後也應建議進行CNV檢測。

關鍵詞：高齡孕婦；拷貝數變異；高通量測序；產前診斷

我國《母嬰保健法實施辦法》明確指出，孕婦預產期年齡超過35周歲（高齡孕婦）是產前診斷的適應證。基因組拷貝數變異（copy number variations，CNV）為常見的染色體結構異常，常見臨床表現為發育遲緩、智力障礙、精神行為異常等。
目前有約300種微缺失/微重複症候群被報導，發病率為1/200 000~1/4000，合併發病率近1/600［1］。Liang等［2］的研究證實，拷貝數變異測序（copy number variation sequencing，CNV-seq）技術可取得與單核苷酸多態性微陣列（SNP array）技術完全一致的檢測結果，甚至在某些方面優於SNP array；Dong等［3］研究表明，CNV-seq可應用於產前或產後的染色體微重複或微缺失的遺傳學診斷。本研究對自願選擇羊膜腔穿刺的高齡孕婦的羊水樣本同時進行染色體核型分析和CNV-seq檢測。現報導如下。
 
1    資料與方法

1.1   一般資料    收集 2018年1月1日至12月31日因預產期年齡＞35周歲自願於哈爾濱醫科大學附屬第一醫院產前診斷中心進行羊膜腔穿刺的孕婦247例。孕周18~23周，年齡35~45歲。研究對象均籤署知情同意書。本研究經本院倫理委員會批准，所有孕婦均知情同意。

1.2   方法    （1）細胞培養及染色體製備。將胎兒羊水20mL離心後棄上清後用羊水培養基混懸後分別放入2個培養瓶中培養7~10d後收穫；經秋水仙素、低滲、固定等處理步驟製成懸液後，滴片2~3張，75℃烤片3h後顯帶，Gimsa染色，利用ASI染色體分析系統進行後續染色體核型分析。常規分析5個分裂象，計數30個分裂象，按照《細胞遺傳學國際體制ISCN 2013標準》進行核型描述及診斷。（2）利用CNV-seq檢測胎兒羊水5mL常規提取基因組DNA，使用Nextseq CN500測序平臺測序，後期數據分析。發現的CNVs與國際基因組CNVs多態性資料庫（DGV）、表型資料庫和人類基因組資料庫（UCSC）進行比對，按照《美國醫學遺傳學與基因組學學會ACMG序列變異分類標準與指南2015》進行結果致病性分析及描述診斷。

1.3   統計學方法    採用SPSS19.0軟體對資料進行統計學分析。計量資料以均數±標準差表示；計數資料以頻數和率表示，組間比較採用卡方檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2    結果

2.1   染色體核型分析結果   247例羊水標本中，染色體核型分析和CNV-seq同時檢測出染色體非整倍體共計21例，其中21-三體症候群14例，18-三體症候群2例，13-三體症候群1例，性染色體非整倍體4例。

染色體核型分析檢出性染色體非整倍體1例（為45，XO［3］/46，XX［97］）；染色體結構異常9例，其中染色體易位4例，染色體正常變異3例，2例染色體結構異常經CNV-seq檢測最終確定異常片段的來源。染色體核型異常檢出率為12.55%（31/247）。見表1。

2.2   CNV-seq檢測結果   在216例染色體核型分析結果正常的羊水樣本中，CNV-seq額外檢出明確致病CNV 4例，臨床意義未明的染色體微缺失6例（其中1例為父源，1例為母源，其餘4例未進行夫婦驗證），CNV多態性15例。在247例羊水樣本中CNV的總檢出率為19.43%（48/247），與染色體核型檢出率（12.55%）比較差異有統計學意義（P＜0.05）。CNV-seq比核型分析額外增加了6.88%的檢出率，其中染色體核型正常的羊水樣本中明確致病的CNV檢出率為1.62%（4/247）。見表2。

3    討論

有研究報導，孕婦的年齡增長會導致出生缺陷發生率的上升［4］。本研究中，高齡孕婦胎兒染色體異常檢出率為12.55%，比文獻報導各種羊水穿刺指徵的檢出率3.96%高約3倍，高於新生兒自然發生率（0.67%~0.83%）［5］。在本研究中診斷的胎兒染色體非整倍體中，除1例羊水染色體核型結果是3%的45，X嵌合，CNV-seq未檢出異常的胎兒足月自然分娩外（生後狀態良好），均選擇終止妊娠。隨著高通量測序技術的發展，母血清胎兒游離DNA檢測在非整倍體的篩查中得以應用［6］。本研究中有23例高齡孕婦優先選擇母血清胎兒游離DNA檢測，其中結果提示21-三體症候群高風險，羊水穿刺確診12例，假陽性1例。性染色體高風險5例，羊水穿刺確診3例，假陽性2例；13-三體症候群高風險4例，羊水穿刺確診1例，假陽性3例；18-三體症候群高風險1例，為假陽性；母血清胎兒游離DNA檢測高風險的高齡孕婦，羊水穿刺確診為染色體病的概率為69.57%，提示具備2項以上產前診斷指徵的孕婦其胎兒染色體異常的概率增加。
    
本研究中，除1例3%的45，X嵌合的染色體非整倍體CNV-seq未檢出異常，其餘均與染色體核型分析一致，說明CNV-seq對於染色體數目異常的低比例嵌合存在漏診。值得注意的是，現階段CNV-seq技術在產前診斷中的應用仍要注意以下問題：與SNP晶片相比，CNV-seq無法檢測單親二倍體；與核型分析相比，CNV-seq無法檢測多倍體和結構異常，會導致漏診。CNV-seq在產前診斷中的應用研究較少，仍然需要更多的研究數據支撐，從而為遺傳諮詢和產前診斷提供精確的信息。
      
本研究中，有2例染色體結構異常，CNV-seq均提示大片段的重複，對這2例夫婦進行染色體檢查發現，夫婦一方為染色體平衡易位的攜帶者，這2例胎兒臨床建議終止妊娠。
      
平衡易位是染色體結構異常最常見的形式，平衡易位不僅是自然流產、不孕症等生育疾患的重要原因，也是產前診斷的重要指徵之一。值得關注的是，儘管平衡易位攜帶者通常由於沒有遺傳物質的丟失、重複，不產生遺傳效應，但也有少部分攜帶者在染色體斷裂、重接過程中，破壞了相關功能基因的表達，從而導致臨床異常表型［7-10］。因此，對產前診斷中染色體平衡易位的胎兒，遺傳諮詢應慎重，有必要將CNV-seq運用到臨床診斷中協助指導妊娠結局。
      
本研究發現，在羊水染色體核型正常的胎兒中新發CNV4例，新發CNV的檢出率為1.62%（4/247），其中1例16p11.2缺失0.3Mb超聲提示發育遲緩而終止妊娠，另1例17p12缺失1.32Mb超聲無異常表現，分析原因為：CNV報告中提示為常染色體顯性遺傳的周圍神經麻木及肌無力，多青少年起病，夫婦因育有一先天性心臟病男童，無法再接受異常的胎兒出生而選擇終止妊娠；另2例新發的CNV，有1例15q25.2缺失1.52Mb為隱性遺傳，經充分臨床諮詢後，夫婦決定保留胎兒，經電話隨訪至生後半年未見異常；1例10q26.3重複1.44Mb與高三醯甘油血症及自閉症相關，隨訪至生後半年未見異常；分析原因可能為：高三醯甘油血症隨著生長發育才能有顯著的臨床表現，此方面的數據需在後續隨訪中繼續完善；有2例微重複微缺失為親源性；4例微重複未進行夫婦驗證，這6例隨訪至生後半年未見異常；另有15例CNV提示為多態性，隨訪均正常。
      
綜上所述，高齡孕婦胎兒基因組拷貝數變異檢出率為19.43%，此外，CNV-seq比核型分析檢出率額外增加6.88%，其中明確致病的基因組拷貝數變異發生率為1.62%。故對進行產前診斷的高齡孕婦，在排除了常見的非整倍體異常後，應建議進行基因組拷貝數變異檢測［11］。CNV-seq是染色體畸變檢測的有效技術手段，2019年我國發表了CNV-seq產前診斷的專家共識［12］，對該技術的臨床應用進行了規範，進而對於該技術的應用推廣起到了良好的促進作用。

參考文獻略.

來源：王洪玲，王穎，劉璐瑤，李淑媛等，高齡孕婦胎兒基因組拷貝數變異發生率研究[J],《中國實用婦科與產科雜誌,2020,36(9).

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