基因晶片技術進展及應用

1　基因晶片概述

本文引用地址：http://www.eepw.com.cn/article/199406.htm

隨著人類基因組計劃( Human Genome Project)即全部核苷酸測序的即將完成，人類基因組研究的重心逐漸進入後基因組時代（ Postgenome Era）向基因的功能及基因的多樣性傾斜。通過對個體在不同生長發育階段或不同生理狀態下大量基因表達的平行分析，研究相應基因在生物體內的功能，闡明不同層次多基因協同作用的機理，進而在人類重大疾病如癌症、心血管疾病的發病機理、診斷治療、藥物開發等方面的研究發揮巨大的作用。它將大大推動人類結構基因組及功能基因組的各項基因組研究計劃。

基因晶片的工作原理與經典的核酸分子雜交方法（southern 、northern）是一致的，都是應用已知核酸序列作為探針與互補的靶核苷酸序列雜交，通過隨後的信號檢測進行定性與定量分析，基因晶片在一微小的基片（矽片、玻片、塑料片等）表面集成了大量的分子識別探針，能夠在同一時間內平行分析大量的基因，進行大信息量的篩選與檢測分析。基因晶片主要技術流程包括：晶片的設計與製備；靶基因的標記；晶片雜交與雜交信號檢測。

基因晶片的設計實際上是指晶片上核酸探針序列的選擇以及排布，設計方法取決於其應用目的，目前的應用範圍主要包括基因表達和轉錄圖譜分析及靶序列中單鹼基多態位點（single nucleotide polymorphism，SNP）或突變點的檢測，表達型晶片的目的是在雜交實驗中對多個不同狀態樣品(不同組織或不同發育階段、不同藥物刺激)中數千基因的表達差異進行定量檢測，探針序列一般來自於已知基因的cDNA 或EST庫，設計時序列的特異性應放在首要位置，以保證與待測目的基因的特異結合，對於同一目的基因可設計多個序列不相重複的探針，使最終的數據更為可靠。基因單鹼基多態檢測的晶片一般採用等長移位設計法，即按靶序列從頭到尾依次取一定長度的互補的核苷酸序列形成一探針組合，這組探針是與靶序列完全匹配的野生型探針，然後對於每一野生型探針，將其中間位置的某一鹼基分別用其它三種鹼基替換，形成三種不同的單鹼基變化的核苷酸探針，這種設計可以對某一段核酸序列所有可能的SNPs位點進行掃描。

晶片製備方法主要包括兩種類型：(1)點樣法：首先是探針庫的製備, 根據基因晶片的分析目標從相關的基因資料庫中選取特異的序列進行PCR擴增或直接人工合成寡核苷酸序列，然後通過計算機控制的三坐標工作平臺用特殊的針頭和微噴頭分別把不同的探針溶液逐點分配在玻璃、尼龍以及其它固相基片表面的不同位點上，通過物理和化學的方法使之固定，該方法各技術環節均較成熟，且靈活性大，適合於研究單位根據需要自行製備點陣規模適中的基因晶片。(2)原位合成法：該法是在玻璃等硬質表面上直接合成寡核苷酸探針陣列，目前應用的主要有光去保護並行合成法，壓電列印合成法等，其關鍵是高空間解析度的模板定位技術和高合成產率的DNA化學合成技術，適合製作大規模DNA探針晶片，實現高密度晶片的標準化和規模化生產。

待分析樣品的製備是基因晶片實驗流程的一個重要環節, 靶基因在與晶片探針結合雜交之前必需進行分離、擴增及標記。標記方法根據樣品來源、晶片類型和研究目的的不同而有所差異。通常是在待測樣品的PCR擴增、逆轉錄或體外轉錄過程中實現對靶基因的標記。對於檢測細胞內mRNA表達水平的晶片，一般需要從細胞和組織中提取RNA，進行逆轉錄，並加入偶聯有標記物的dNTP，從而完成對靶基因的標記過程，對於陣列密度較小的晶片可以用同位素，所需儀器均為實驗室常規使用設備，易於開展相關工作，但是在信號檢測時，一些雜交信號強的點陣容易產生光暈，幹擾周圍信號的分析。高密度晶片的分析一般採用螢光素標記靶基因，通過適當內參的設置及對螢光信號強度的標化可對細胞內mRNA的表達進行定量檢測。近年來運用的多色螢光標記技術可更直觀地比較不同來源樣品的基因表達差異，即把不同來源的靶基因用不同激發波長的螢光素標記，並使它們同時與基因晶片雜交，通過比較晶片上不同波長螢光的分布圖獲得不同樣品間差異表達基因的圖譜，常用的雙色螢光試劑有Cy3- dNTP和Cy5- dNTP。對多態性和突變檢測型基因晶片採用多色螢光技術可以大大提高晶片的準確性和檢測範圍，例如用不同的螢光素分別標記靶序列及單鹼基失配的參考序列，使它們同時與晶片雜交，通過不同螢光強弱的比較得出靶序列中鹼基失配的信息。

基因晶片與靶基因的雜交過程與一般的分子雜交過程基本相同，雜交反應的條件要根據探針的長度、GC鹼基含量及片的類型來優化，如用於基因表達檢測，雜交的嚴格性較低，而用於突變檢測的晶片的雜交溫度高，雜交時間短，條件相對嚴格。如果是用同位素標記靶基因，其後的信號檢測即是放射自顯影，若用螢光標記，則需要一套螢光掃描及分析系統，對相應探針陣列上的螢光強度進行分析比較，從而得到待測樣品的相應信息。由於基因晶片獲取的信息量大，對於基因晶片雜交數據的分析、處理、查詢、比較等需要一個標準的數據格式，目前，一個大型的基因晶片的資料庫正在構建中，將各實驗室獲得的基因晶片的結果集中起來，以利於數據的交流及結果的評估與分析。

2　基因晶片的應用

基因表達圖譜的繪製是目前基因晶片應用最廣泛的領域，也是人類基因組工程的重要組成部分，它提供了從整體上分析細胞表達狀況的信息，而且為了解與某些特殊生命現象相關的基因表達提供了有力的工具，對於基因調控以及基因相互作用機理的探討有重要作用。人類基因組編碼大約100000個不同的基因，因此，具有監測大量mRNA的實驗工具很重要。基因晶片技術可清楚地直接快速地檢測出以1∶300000水平出現的mRNA，且易於同時監測成千上萬的基因。目前，已能夠在1.6cm2面積上合成和閱讀含400000個探針的陣列，可監測10000個基因的表達狀況。史丹福大學的Brown用製備的酵母cDNA晶片，獲得酵母在不同細胞周期狀態以及在熱休克冷休克處理後其2473個基因的表達圖譜，較直觀地反應了不同條件和狀態下基因轉錄調控水平，從而為尋找基因調控的機理提供了一條有效的途徑。

定量監測大量基因表達水平在闡述基因功能、探索疾病原因及機理、發現可能的診斷及治療的靶基因等方面具有重要價值的。Derisi等選用來自惡性腫瘤細胞系UACC903中的1161個cDNA克隆製成晶片，通過比較正常和腫瘤細胞的表達差異，發現在惡性腫瘤細胞中P21基因處於失活或關閉狀態，但在逆轉的細胞系中呈高表達。Golub等應用cDNA 晶片檢測基因表達的差異進行癌症的分類，成功地區分出急性髓細胞性白血病（AML）和急性淋巴細胞性白血病（ALL），預期這種方法還能診斷出新的白血病種類。在炎症性疾病類風溼性關節炎(RA)和炎症性腸病(IBD)的基因表達研究中，可檢測出炎症疾病誘導的基因如TNF-α、IL或粒細胞集落刺激因子，同時發現一些以前未發現的基因如HME基因和黑色素瘤生長刺激因子。目前，大量湧現的人類ESTs給cDNA微陣列提供了豐富的序列資源，資料庫中ESTs代表了人類基因，因此ESTs微陣列可在缺乏其它序列信息的條件下用於基因發現和基因表達檢測，從而加快人類基因組功能分析的進程。

基因晶片的另一重要應用是基因多態位點及基因突變的檢測，現有大量實例說明，基因組多樣性的研究對闡明不同人群和個體在疾病的易感性和抵抗性方面表現出的差異具有重要意義，一旦對基因組的編碼序列進行系統篩查，就有可能找出與疾病易感性有關的大量基因變異。基因晶片技術可大規模地檢測和分析DNA的變異及多態性。Wang等應用高密度基因晶片對2.3Mb人類基因的SNP 進行篩查，確定了3241個SNPs位點，顯示出大規模鑑定人類基因型的可能。Lipshutz等人採用含18,495個寡核苷酸探針的微陣列，對HIV-1基因組反轉錄酶基因(rt)及蛋白酶基因(pro)的高度多態性進行了篩選，這些變異將導致病毒對多種抗病毒藥物包括AZT、ddI、ddC等表現出抗性，因此rt與pro的變異與多態性的檢測具有重要的臨床意義。隨著大量疾病相關基因的發現，變異與多態性分析將在疾病的診斷與治療方面體現出越來越重要的價值。Affymetrix公司已將P53 基因的全長序列和已知突變的序列製成探針集成在晶片上，可對與P53 基因突變相關的癌症進行早期診斷。Hacia等採用含96600個20聚寡核苷酸高密度陣列對遺傳性乳腺和卵巢癌BRCA1基因3.45kb的第11個外顯子進行雜合變異篩選，結果準確診斷出15個已知變異的患者樣品中的14個，而在20個對照樣品中未發現1例假陽性，表明DNA晶片技術在某些疾病相關基因可能的雜合變異的檢測方面所具有的靈敏度與特異性是令人滿意的。

晶片技術中雜交測序技術（sequencing by hybridization,SBH）是一種新的高效快速測序方法，也是基因晶片的另一重要應用，其原理與晶片檢測多態位點相類似，即通過與一組已知序列的核酸探針雜交進行序列測定，用螢光標記的待測序列與基因晶片上對應位置的核酸探針產生互補配對時，通過確定螢光強度最強的探針位置，獲得一組序列互補的探針序列，據此可重組出靶核酸的序列。用含65536個8聚寡核苷酸的微陣列，採用SBH技術，可測定200bp長DNA序列採用67108864個13聚寡核苷酸的微陣列，可對數千個鹼基長的DNA測序。

3　結束語

基因晶片技術的出現不過短短幾年時間，其發展勢頭十分迅猛，在生命科學的各個領域得到廣泛地應用，但其存在的缺陷也是相當明顯的。首先是成本的問題，由於晶片製作的工藝複雜，信號檢測也需專門的儀器設備，一般實驗室難以承擔其高昂的費用，其次在晶片實驗技術上還有多個環節尚待提高，如在探針合成方面，如何進一步提高合成效率及晶片的集成程度是研究的焦點。而樣品製備的簡單化與標準化則晶片應用進一步普及的前提。雖然晶片技術還存在這樣或那樣的問題，但其在基因表達譜分析、基因診斷、藥物篩選及序列分析等諸多領域已呈現出廣闊的應用前景，隨著研究的不斷深入和技術的更加完善基因晶片一定會在生命科學研究領域發揮越來越重要的作用。