畢赤酵母表達的培養基配製大全

　　

　　畢赤酵母表達的培養基配製大全

　　畢赤酵母表達的培養基配製

　　2.1 LB(Luria-Bertani)培養基：

　　Trypton l%

　　Yeast Extract 0.5%

　　NaCl l%

　　PH 7.0

　　製作平板時加入 2%瓊脂 粉。121℃高壓滅菌 20min。可於室溫保存。用於培養pPICZαA原核宿主菌TOP10F』時可加入Zeocin 25ug / ml。

　　2.2 LLB(Low Salt LB)培養基：

　　Trypton l%

　　Yeast Extract 0.5%

　　NaCl 0.5%

　　PH 7.0

　　製作平板時加入 2%瓊脂 粉。121℃高壓滅菌 20min。可於室溫保存數月。用於培養pPICZαA原核宿主菌TOP10F』時，加入Zeocin 25ug / ml，可以4℃條件下保存1～2周。

　　2.3 YPD (又稱YEPD)

　　Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，(Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，酵母浸出粉/胰蛋白腖/右旋葡萄糖培養基)

　　Trypton 2%

　　dextrose (glucose) 2%

　　+agar 2%

　　+Zeocin 100 μg/ml

　　液體YPD培養基可常溫保存;瓊脂 YPD平板在4℃可保存幾個月。加入Zeocin 100ug / ml，成為YPDZ培養基，可以4℃條件下保存1～2周。

　　2.4 YPDS + Zeocin 培養基(Yeast Extract Peptone Dextrose Medium)：

　　yeast extract 1%

　　peptone 2%

　　dextrose (glucose) 2%

　　sorbitol (山梨醇)1 M

　　+agar 2%

　　+ Zeocin 100 μg/ml

　　不管是液體 YPDS培養基，還是YPDS + Zeocin 培養基，都必須存放4℃條件下，有效期1～2周。

　　2.5 MGY

　　Minimal Glycerol Medium (最小甘油培養基)

　　(34%YNB;1%甘油;4*10-5%生物素)。將800ml滅菌水、100ml的 10*YNB母液、2ml的500*B母液和100ml的10*GY母液混勻即可，4℃保存，保存期為2個月。

　　2.6 MGYH

　　Minimal Glycerol Medium + Histidine (最小甘油培養基 + 0.004%組氨酸)

　　在1000ml的MGY培養基中加入 10ml的100*H母液混勻，4℃保存，保存期為2個月。

　　2.7 RD

　　Regeneration Dextrose Medium (葡萄糖再生培養基)

　　(含有：1mol/L的山梨醇;2%葡萄糖;1.34%YNB;4*10-5%生物素;0.005%胺基酸)

　　1. 將186g的山梨醇定容至700ml，高壓滅菌;

　　2. 冷卻後於45℃水浴;

　　3. 將100ml的10*D、100ml的10*YNB;2ml的500*B;10ml的100*AA等母液和88ml無菌水混勻，預熱至45℃後，與步驟2 的山梨醇溶液混合。4℃保存。

　　2.8 RDH

　　Regeneration Dextrose Medium + Histidine (葡萄糖再生培養基 + 0.004%組氨酸)

　　在RD培養基配製的第三步中，在加入10ml的100*H母液，同時無菌水的體積減少至78ml即可，其餘配製方法與RD相同。4℃保存。

　　2.9 RD及RDH平板的製備

　　1. 將186g的山梨醇和15-20g瓊脂 粉定容至700ml，高壓滅菌;冷卻後於60℃水浴;

　　2. 參照RD/RDH液體培養基配製的步驟4，將100ml的10*D、100ml的10*YNB;2ml的500*B;10ml的100*AA等母液、(10ml的100*H母液)和88(78)ml無菌水混勻，預熱至45℃後，與步驟1的山梨醇/瓊脂 液混勻;

　　3. 迅速製備平板。4℃可保存數月。

　　2.10 RD及RDH 的TOP 瓊脂的製備(常用於酵母菌的包被)

　　1.將186g的山梨醇和 7.5~10g瓊脂粉定容至700ml，高壓滅菌;冷卻後於60℃水浴;

　　2.參照RD/RDH液體培養基配製的步驟4，將100ml的10*D、 100ml的10*YNB;2ml的500*B;10ml的100*AA等母液、(10ml的100*H母液)和88(78)ml無菌水混勻，預熱至 45℃後，與步驟1的山梨醇/瓊脂液混勻;

　　3.將該TOP瓊脂置於45℃水浴冷卻、保溫，備用。

　　2.11 MD與MDH

　　Minimal Dextrose Medium +(Histidine) 最小葡萄糖培養基 +( 0.004 %組氨酸)

　　(含有：1.34%YNB;;4*10-5% 生物素;2%葡萄糖)

　　1. 100ml的10*YNB;2ml的500*B和100ml10*D母液，用800ml的無菌水定容至1000ml即可;

　　2. 如配製MDH，可在上述的MD中加入10ml的100*H即可;

　　3. 如配製平板，可無菌水的滅菌前，加入15~20g的瓊脂。4℃可保存數月。

　　2.12 SOC培養基：

　　Trypton l%

　　Yeast Extract 0.5%

　　NaCl 0.05%

　　Glucose (1mol / L) 2%

　　121℃高壓滅菌 20min，冷卻後，4℃保存

　　2.13 MM培養基：

　　M9母液：64g磷酸氫二鈉，15g磷酸二氫鉀，2.5g氯化鈉，5.0g氯化銨加1L水滅菌

　　取M9母液200ml加水700ml,加2ml1mol/l已滅菌的硫酸鎂，加100微升已滅菌的1mol/l氯化鈣(可加可不加)。注意硫酸鎂和M9母液要分開滅菌不然會有沉澱。在M9培養基基礎上添加0.5%葡萄糖即為MM培養基。

　　2.14 BMGY /BMMY培養基：

　　酵母粉：1.0克，蛋白腖：2.0克，YNB：1.34克，0.1mol/L pH6.0(或者pH7.0)磷酸緩衝液，甘油：1.0毫升，加蒸餾水到100mL

　　2.15 BMM培養基，全稱：Buffered minimal methanol 即最小緩衝甲醇培養基，常用於表達分泌型蛋白的培養基。

　　配製：

　　100mM pH6.0磷酸鉀 1.34%YNB 4×10-5%生物素 0.5%甲醇

　　1. 滅菌700ml 水，

　　2. 冷至室溫，加入下列：100ml 1M pH6.0磷酸鉀緩衝液, 100ml 10×YNB, 2ml 500×B, 100ml 10×M

　　3. 放置於4 度，可放2 個月

　　10×YNB (13.4%酵母氮源鹼(YNB)含硫酸銨不含胺基酸)

　　溶解134gYNB於1000ml水中，過濾除菌，加熱至YNB 完全溶解，存於4 度。或者用34gYNB(不含硫酸銨不含胺基酸)，100g 硫酸銨進行配製，可放1年。注意畢赤酵母在高濃度YNB下生長更好。

　　YPD：最基本的培養用;BMGY：誘導表達前培養用;BMMY：誘導表達用;MD：電轉化後篩選his+用。

　　YEPD是不能代替BMGY的，因為有葡萄糖，這樣殘留的葡萄糖會影響下一步的誘導表達。不過有一種方法是可行的，就是用YPG培養基代替，只是把YEPD中的葡萄糖用3%的甘油代替，也可以降低成本。搖瓶畢竟不能和發酵罐比，甘油殘餘會抑制甲醇利用。

　　BMGY、BMMY滅菌後才能加甲醇、磷酸鉀、生物素。配製BMMY時也沒必要用5%過濾除菌的甲醇，在滅菌後使用前加100%甲醇至你要的濃度。

　　YNB可以高壓滅菌，沒問題的，也可以0.22um過濾處理，天冬氨酸和蘇氨酸要待培養基高壓滅菌後加入;配YPD時可以加入YPD一起滅菌，但時間不能太長，溫度不能太高，一般121-125度12-15分鐘足夠了。若時間過長，溫度過高，可能導致YPD焦化。glucose和含氮化合物在一起容易產生美拉德反應，這是配製培養基中的禁忌。顏色很深的話，基本不能使用了。或者含有葡萄糖和/或YNB的培養基108度35min高壓滅菌。

　　小量發酵其實可以把培養基成分中的YNB和生物素去除，培養基價格便宜，操作又方便，可以直接滅菌，效果也很好(效果不比含YNB的差)。

　　如果是用自己配置的培養基，如玉米浸提液、麥芽浸提液、麥麩浸提液等等，可以不用換液，採取添料來維持酵母對培養基的營養需要。

　　用無機鹽進行大規模發酵，更省錢。

　　大規模發酵時，甲醇的流加速度增加不要太快。另外使用純氧並不昂貴，在武漢買個鋼瓶600元左右，一瓶純氧20元。一個批次100h左右估計3-4瓶氧氣。

　　關於Tryptone和Peptone的選擇：

　　1)用培養E.coli的Tryptone替代Peptone對有些酵母菌可以,例如一般的表達酵母.但是對有酵母菌些絕對不行.例如做雙雜交的AH109,Y187之類表達酵母，根本就長不好.

　　2)Tryptone和Peptone雖然都是營養腖，但營養成分不一樣.即使是一般的表達酵母可以在Tryptone生長，生長狀態也沒有在Peptone中好.但tryptone和peptone就是含量上有點不同外，其他沒什麼區別，用peptone的目的不是為了提供氮源，提供氮源的是培養基裡面的YNB。

　　3)如果要求不高，一般使用也還湊合.儘可能的用Peptone，difco公司的，晶美公司代理的，甚至是其它國產的蛋白腖都可以很正常的培養絕大多數酵母菌.

　　4)用含Peptone的培養基顏色很深，純化表達蛋白時顏色要去掉，所以還要進行麻煩的後續處理。而改用Tryptone後，培養基顏色變得很淺，和LB(液體)顏色差不多，後續處理要簡單些。invitrogen說明書說 peptone的作用是防止目的蛋白被一些酶類水解，加入peptone的目的就是競爭性抑制目的蛋白的水解，因為peptone是一些小的短肽，是一些酶作用的底物。

　　培養畢赤酵母,書上說BIOTIN儲液是水溶液,但事實上BIOTIN很難溶於水, 可以稍稍水浴加熱一下。

　　配製500×BIOTIN stock solution(0.02%)有這麼3種方案：

　　1)、懶人是將Biotin直接溶在去離子水中，放過夜，基本就能溶;

　　2)、急性子是將溶液配成0.02N的NaOH，就很容易溶解了;

　　3)、水浴加熱，溫度不能高於50度。

　　D-生物素是具有生物活性的生物素，也就是vitaminH。在畢赤酵母代謝過程中，作為多種酶的輔基起作用。天然培養基中一般可以不單獨添加，因為YNB中、酵母粉、蛋白腖中均含有一定量的生物素，但是做高密度發酵還是必須要添加的。MD、MM屬於基礎培養基，沒有哪種成分會含有微量生長因子(如生物素)。所以肯定要加的。

　　附：無機培養基配方

　　BSM無機培養基：

　　85% H3PO4 26.7ml/L

　　CaSO4 ?2H2O 0.93g/L

　　K2SO4 18.2g/L

　　MgSO4?2H2O 14.9g/L

　　KOH 4.13g/L

　　甘油 40g/L

　　PMT1 4.0ml/L

　　100%氨水調pH5.0(1瓶50ml加800ul氨水)或10g/L硫酸銨調pH5.0，氨水用於上罐調pH(便宜，方便)。誘導表達前調pH6.0。pH5.0是為了防止BSM形成磷酸鈣沉澱，pH6.0是表達HSA融合蛋白的最適pH。

　　BSM高壓滅菌後再加4.0ml/L 過濾除菌的PTM1(微量元素)4.0ml/L 。100%的500ml甲醇加6ml PMT1，用於補加甲醇誘導表達目的融合蛋白。

　　PMT1(1L)配方：

　　CuSO4?5H2O 6.0g/L

　　KI 0.088g/L

　　MnSO4?H2O 3.0g/L

　　Na2MoO4?2H2O 0.2g/L

　　H3BO3 0.02g/L

　　CoCl2?6H2O 0.5g/L

　　ZnCl2 20.0g/L

　　FeSO4?7H2O 65.0g/L

　　Biotin 0.2g/L

　　濃H2SO4 5.0ml