「共生」改變脂肪肝患者糞便微生物群，但不改變肝臟脂肪纖維化

導讀

背景與目的： 腸道菌群失調與非酒精性脂肪肝疾病（ NAFLD ）有關。我們調查了益生菌與益生元相組合的合生元是否影響肝臟脂肪含量， NAFLD 患者的肝纖維化以及糞便微生物組的組成。

方法：我們在英國對104例NAFLD患者進行了一項雙盲2期試驗。參加者（平均年齡，50.8±12.6歲；男性為65％；37％為糖尿病患者）隨機分配給定合生元藥物（低聚果糖，4g兩次每天，加上Bifidobacterium animalis subs. Lacits BB-12;n = 55）或安慰劑（n = 49）持續10-14個月。在研究的開始和結束時，通過核磁共振光譜法（MRS）測量肝臟脂肪含量，肝纖維化是由經過驗證的生物標誌物評分系統以及振動控制的瞬態彈性成像來確定。分別在研究的開始和結束收集糞便樣本，並通過16S rDNA測序分析了糞便微生物群。

結果：在實驗開始（基線）和研究結束時，合生元組的脂肪含量百分比值分別為32.3％±24.8％和28.5％±20.1％；安慰劑組為31.3％±22％和25.2％±17.2％。在未經參數校準的情況下，我們沒有發現肝臟脂肪在兩組中有顯著差異（β= 2.8；95％CI，-2.2至7.8； P = 0.30）。在參數校準後的回歸模型中（針對基準肝臟脂肪加上年齡，性別，體重差異和基線體重），僅體重的減輕與肝臟脂肪減少有關（β= 2； 95％CI，1.5-2.6；P = 0.03）。接受合生元幹預的患者的糞便樣本中與基線相比，糞便的Bifidobacterium 和Faecalibacterium的豐度上升，以及Oscillibacter和Alistipes豐度的減少；安慰劑組未觀察到這些變化。糞便微生物群的組成變化與肝臟脂肪含量或肝臟纖維化無關。

結論：在一項針對NAFLD患者的隨機試驗中，1年內給予合生元幹預（益生菌和益生元）改變了糞便微生物群，但沒有改善肝臟脂肪含量或肝纖維化。

論文ID

原名：Synbiotic Alters Fecal Microbiomes, but not Liver Fat or Fibrosis, in a Randomized Trial of Patients With Non-alcoholic Fatty Liver Disease

譯名：在一項針對非酒精性脂肪肝患者的隨機試驗中，「共生」改變了糞便微生物群，但不改變肝臟脂肪或纖維化

期刊：Gastroenterology

IF：19.233

發表時間：2020.1.25

通訊作者：Eleonora Scorletti

作者單位：Faculty of Medicine, University of Southampton and Division of Gastroenterology, University of Pennsylvania

實驗設計

104名已證明NAFLD的參與者被隨機分配至合生元幹預組或安慰劑組，實驗期為最少10個月，最多14個月（圖1）。對於實驗期間抗生素的使用我們有規定以便實驗結果準確，實驗幹預期最多允許患者進行兩個療程的抗生素服用，在實驗測量前的一個月不允許有抗生素的服用。55名參與者被隨機分配接受合生元治療，合生元包括果糖寡糖，聚合度<10，每袋4 g，每天兩次（兩袋一天，放入冷飲中攪拌服用）再加上Bifidobacterium animalis subsp. lactisBB-12，每天服用至少100億個CFU（每天1個膠囊），有49名參與者隨機接受安慰劑，每天兩次服用4克麥芽糖糊精（每天1粒膠囊每天加兩小包，攪拌成冷飲）。

圖1 實驗設計

結果

104個參與者中有89個完成了整個幹預階段（58個男性，31個女性）表1顯示了，在基線上，合生元組和安慰劑組之間的肝臟指標，雙歧桿菌豐度以及主要臨床和生化參數沒有差異。表2顯示了基線與實驗結束時之間一些生理生化指標的變化。在基線水平上，腸通透性測量（乳果糖/甘露醇）為：中位數= 0.11，四分位間距（IQR）= 0.25；平均值±標準差0.27±0.4（表2）。由於實驗設計對象不是健康的對照組，我們將基線乳果糖/甘露醇比率與健康受試者的比率進行了比較。值得注意的是，乳果糖/甘露醇比的平均值和中值比健康受試者大10倍，說明在NAFLD患者中腸道通透性改變。我們發現在合生元幹預組和安慰劑組中在基線和實驗結束時腸道通透性都沒有變化。有趣的是，89位患者完成了實驗後，通過MRS測量的肝臟脂肪含量總體減少了65％。關於LPS，在安慰劑組（p = 0.80）或治療組（p = 0.40）中基線與實驗終點之間都沒有差異。合生元的治療未影響LPS在血清的水平。在研究結束時，肝臟脂肪變化與LPS變化之間的沒有關聯（p = 0.80）。我們使用一個回歸模型來觀察合生元對糞便SCFA的影響，這個模型歸納了各個SCFA的差異，年齡，性別，組別以及基線的SCFA水平。我們發現合生元並未對SCFA產生影響（總SCFAp = 0.21；乙酸p = 0.23;丙酸p = 0.24;丁酸p = 0.40）。關於肝臟脂肪含量，我們採用肝臟脂肪含量差異作為回歸模型結果變量，對性別，年齡，體重差，基線體重，在基線的肝臟脂肪含量和SCFA的差異進行校準。我們發現SCFA的變化與肝臟脂肪百分比的變化沒有關係：SCFAs = 0.63；乙酸p = 0.62;丙酸p = 0.78；丁酸p = 0.73。

表1 所有參試者在基線水平上的生理生化指標，括號裡表示標準差。

表2 合生元幹預組和安慰機組參試者的生理生化指標，括號裡表示標準差。

意向處理分析Intention to Treat (ITT) Analysis

表3展示了基線水平和實驗結束時的主要數據以及多元線性回歸模型。在合生元幹預組，肝臟脂肪減少4% (p=0.08)，Bifidobacterium顯著增加(p<0.001)。合生元對肝臟脂肪減少沒有顯著的作用。在安慰劑組，肝臟脂肪顯著減少6%(p=0.01)，Bifidobacterium沒有變化(p=0.5)。在未進行參數校準的分析中，肝臟脂肪變化在兩組之間不顯著(β=2.8; 95%CI:-2.2, 7.8;p=0.3），在性別，年齡，體重差別，體重的基線水平，肝臟脂肪含量的基線水平進行參數校準後，合生元和安慰劑組剛好到達顯著水平(β=4.1; 95%CI:-0.02, 8.3; p=0.05)。

在多變量回歸模型中，體重減少是與肝臟脂肪顯著減少的唯一相關因素每公斤體重減輕與肝臟脂肪減少2％有相關性（β= 2.0; 95％CI：1.5，2.6; p = 0.03）（表3）。我們然後以肝臟脂肪差異作為結果變量進行回歸建模，體重變化（這裡是體重減少）作為解釋變量。數據表明體重減少是與肝臟脂肪顯著減少密切相關（β= 1.9； 95％CI 1.4, 2.5；p ＜0.001）。我們使用了2個肝臟纖維化評分模型（即ELF和NAFLD纖維化評分），我們採用了與肝臟脂肪相同的回歸模型校準了纖維化得分的基線結果以及年齡，性別，體重差異和基線體重。我們沒有發現肝纖維化評分與合生元治療相關（表3）。我們還測試了肝臟的硬度測量值（kPa）對合生元幹預的反應（由VCTE評估）。在包含基線和實驗結束時的肝硬度數據差值作為結果變量的回歸模型中，對肝硬度基線測量值以及年齡，性別，體重差異和基線體重進行參數調整後，發現合生元與肝硬度的變化無關（B係數= -0.78（95％CI -1.93，0.37），p = 0.18）。因此，這些數據表明，合生元不太可能影響肝臟脂肪或肝纖維化。體重減輕與肝臟纖維化和肝硬度改善有關：ELF（p = 0.039）和NAFLD纖維化評分（p = 0.027）（表3），以及肝硬度值（p = 0.025）有關。有趣的是，在合生元組內，發現Bifidobacteriumspp.豐度的變化與肝臟脂肪的變化有負相關（Spearman rho =-0.36，p = 0.017）。但是，在對體重變化，年齡和性別進行參數調整之後，不再有關聯了（Spearman的rho = -0.10，p = 0.51）。我們還測試了Bifidobacteriumspp.豐度的變化與研究結束時主要實驗結果的關聯，值得注意的是，我們沒有發現研究結束時Bifidobacteriumspp.豐度的變化和肝臟脂肪變化以及纖維化評分有關聯。而且，體重變化與合生元治療以及Bifidobacteriumspp. 豐度的變化之間沒有關聯。在一個使用Bifidobacteriumspp.豐度的變化作為結果變量的多變量回歸模型中，對分組，年齡，研究結束時的性別和體重差異進行參數調整後，體重差異，年齡和性別與雙Bifidobacteriumspp.豐度變化無明顯關聯。

表3 肝臟脂肪含量以及纖維化評分，以及合生元幹預和Bifidobacteriumspp.對這些指標影響的回歸模型。*表示模型只對指標基線水平進行校準。**除對指標基線水平進行校準以外，還考慮了年齡，性別，體重變化以及體重的初始值。

糞便菌群分析

在基線時，兩組之間的糞便微生物組無差異。（表S4，表S5，圖S1），Sphingomonas 和 Sutterella與肝纖維化評分之間的有正相關，而Olsenella與MRS測量的肝臟脂肪之間有負相關。Clostridia和 Firmicutes與肝纖維化得分有負相關（表4）。總細菌含量不受合生元幹預的影響（圖S2）。合生元治療與減少個體內微生物豐富度多樣性（α-多樣性）有正相關（richness level），但在均勻度水平（evenness level）或均勻度和豐富度水平（evenness and richness levels）（表S4）上沒有關係，合生元可能與低豐度的菌種的消失有關。從β多樣性指數Morisita-Horn可以看到微生物群落之間的差異（圖2A，主坐標分析）。觀察到的β多樣性分布主要是由於個體間的差異（解釋了總變化的86％，ANOSIM，1000 permutationtest，p = 0.001）。為了評估合生元治療與安慰劑治療相比是否對微生物群結構有更大影響，我們比較了來自同一個個體的每一對樣本（基線和研究結束，通過β多樣性指數計算）（圖2B）。合生元組顯示出比安慰劑組更高的β多樣性值，表明合生素治療對腸道菌群的影響更大。當觀察其他β-多樣性時，如Binary-Jaccard和Bray-Curtis獲得了相似的結果（圖2B）。按照這些觀察結果，與安慰劑相比，合生元治療促進了Bifidobacterium 和Faecalibacterium 減少了 Oscillibacter 和 Alistipes（圖3，表S6），在其上一級分類中也有顯著意義。在門級（圖S3）或任何其他分類上都沒有顯著意義（表S7，圖S4）。通常與炎症，肥胖和NAFLD有關的細菌沒有變化（圖S5）。令人驚訝的是，只有Oscillibacter 在分析調整模型後，與MRS測得的肝臟脂肪有負相關（β=-2.2; 95％CI：-4.3，-0.1； p = 0.04）。Bifidobacterium spp.增加了2.2倍，也通過qPCR確認了這一點（圖S2）。

圖2 A：β多樣性的PCoA分析，觀察腸道菌群的多樣性變化。B：3種β多樣性指標。

圖3 合生元對Bifidobacterium,Faecalibacterium, Oscilibacter以及Alistipes. 豐度的影響。

討論

我們的研究是第一個測試長達12個月合生元治療療效的研究。我們測定了肝臟脂肪含量，NAFLD的纖維化評分（ELF和NAFLD纖維化評分），肝硬度測量，和腸道菌群的變化。在實驗結束時，我們沒有發現合生素和安慰劑組之間任何肝臟脂肪含量，纖維化評分和肝硬度測量值的差異。

我們發現了65％的參與者的肝臟脂肪總體減少僅與體重減少有關，從非標準化的β係數來看，體重減輕1 kg，肝臟脂肪百分比減少2％。體重減輕也與ELF和NAFLD纖維化評分和肝硬度的改善有關。大多數患者的肝臟脂肪含量均有改善，我們猜測與「臨床效應」有關，即參與者將從參與臨床試驗中受益。在參與試驗期間我們給予了健康生活的指導。我們發現合生元組中腸道菌群的變化，並且合生元治療後顯著改變了腸道菌群的多樣性。Bifidobacterium 和Faecalibacterium的增加和Oscillibacter和Alistipes的減少。Bifidobacterium是已知對脂質代謝和腸屏障有一些有益的作用。但是，我們找不到Bifidobacterium與肝臟脂肪變化（在調整了體重減輕之後）或腸道（調整年齡，性別和腸道基線測量值後的通透性滲透性（乳果糖/甘露醇比））上的變化有關。

據報導，抗炎細菌Faecalibacterium prausnitzii在NAFLD中降低，且不依賴於肥胖和胰島素抵抗，並且在攝入菊粉型果聚糖後會增加。Faecalibacterium prausnitzii也顯示與在肝臟門管區（portal tract）的淋巴細胞和Kupffer cells標誌物有負相關。相反，Alistipes spp已顯示與肝炎和氧化應激正相關因此，我們可以推測Faecalibacteriumprausnitzii的增加Alistipes spp減少與合生素治療相關，可能會減輕炎症。特別是，通常與炎症，肥胖和NAFLD的細菌均未受到影響（圖S5）。Raman等人的最新研究，將NAFLD肥胖患者的糞便微生物群與健康對照組進行了比較。這些作者表明，NAFLD患者的Oscillibacter明顯低於健康對照。因為我們這個研究沒有健康對照，所以我們與其他研究做了對比，對比發現Proteobacteria在NAFLD患者中高於健康人群2倍。

在這個研究中，我們選擇Bifidobacterium animalis subsp. lactis BB-12作為益生菌是因為它對宿主有益處以及有很好的定殖能力。聚合度小於10的果寡糖的選擇是基於其能夠刺激Bifidobacteria的增殖。與菊粉相比，果寡糖對我們的Bifidobacterium animalis subsp. lactis BB-12益生菌很較強的親和力，並改善其在宿主中的存活和生長。此外，我們還研究了使用經過驗證的體外糞便細菌培養系統來模擬病情，Bifidobacterium animalissubsp. lactis BB-12以及果寡糖在體外對人類腸道菌群的作用，表明，使用合生元或益生元與單獨的益生菌或陰性對照相比，細菌總數和bifidobacteria總數顯著增加，此外，合生元補充劑耐受良好。

在試驗期間，僅一名患者經歷了一些腸胃不適症狀（腹脹和腸胃氣脹）。我們建議該參與者在一天中分次補充合生元，隨後沒有進一步胃腸道不適進而完成了實驗。很多關於合生元幹預NAFLD實驗，都包括了個體正常藥物幹預。我們的實驗個體除合生元幹預外，沒有其他的可能會減少肝臟脂肪的藥物的幹預，很多研究都沒有考慮或者分析數據時沒有對混雜因子進行校準，例如鍛鍊和體重變化。並且很多研究沒有提到樣本大小，不提供統計功效（Statistical power），樣本量不足會導致1類型的統計學錯誤。這些都會影響實驗結果。之前的研究了囊括了多菌種的合生元對NAFLD影響，對NAFLD有改善作用，可能是因為添加多重菌種比單獨一個菌種效果要好，因為能夠影響更多的腸道細菌種類，而這僅僅我們的猜測，因為這個研究也包括了藥物的使用，並沒有對藥物的影響進行消除。另外一個影響可能是每個個體對合生元的反應是不一樣的。我們的研究沒有對腸道菌群在基線水平上進行隨機區塊分組，所以我們也不知道哪些個體對合生元具有反應。

這個研究我們既有優勢也有劣勢。優勢是：研究的安慰劑對照；長時間的幹預；對參與個體的充分了解；在回歸模型上對混雜因子進行參數調整；我們之前用了體外模型進行模擬。我們的劣勢是：第一，我們只選擇了一中益生菌，儘管Bifidobacterium animalissubspecies lactis (BB12)很容易定殖並有益於腸道以及果寡糖可以改善脂代謝。在腸道菌群失調情況下，革蘭氏陰性菌產生大量毒素，損害腸道，並通過血液循環達到肝臟從而損害肝臟。我們的理論是使用益生菌改善腸道菌群，從而減少腸道毒素對肝臟的危害。其次，該研究被設計為2期臨床試驗，以測試此幹預措施對肝臟脂肪的影響對肝臟脂肪的測量使用的是MRS而非肝臟活檢。已知NAFLD是一種「斑片」疾病和肝臟活檢是侵入性的，昂貴的，並且受樣品變異性的影響。因此，我們沒有實驗設計中包括對肝活檢的要求。MRS是目前被認為是用於精確測量肝臟脂肪改變百分比的非侵入性的金標準技術，並具有出色的重現性和敏感性。另外，MRS是一種非常敏感的技術，肝臟脂肪信號高於背景噪聲水平0.2％以上，就可以得到測量。此外，由於合生元是安全，便宜的營養補充劑，可廣泛獲得，我們還認為，如果合生元在NAFLD的治療中佔有一席之地，那麼可能是在早期疾病發展過程中，對降低肝臟脂肪含量有作用。因此，我們的意圖是測試合生元幹預對肝臟脂肪含量的影響，而不是評估NASH的組織學上的變化，NAFLD活動評分的改善或改善肝纖維化。最後，我們沒有在實驗過程中囊括病人的藥物幹預，因為我們的意圖是測試單用合生素幹預的效果，消除了這個混雜因子。

結論

總之，我們的雙盲，隨機的，對照實驗結果表明，合生元治療，與安慰劑相比，（4 g聚合度<10的低聚果糖，每天兩次服用；再加上Bifidobacterium animalis subsp. lactisBB-12，每天至少100億個CFU，持續約12個月）可以有效改善NAFLD患者的腸道菌群。但是，這種治療方法無法降低的肝臟脂肪含量或改善肝纖維化評分或肝硬度值。有趣的是，合生元和安慰劑組都顯示出，體重減輕了1 kg，且體重每減輕1kg，肝臟脂肪含量就減少2％（有顯著的相關性）。體重減輕也與肝臟纖維化得分和肝硬度有關。因此，我們建議這種合生元對腸道菌群產生的影響可能不會對NAFLD患者肝臟中產生明顯的改變。這種合生元對已知與炎症有關的特定微生物的改變需要我們對NAFLD中的炎症/免疫相關參數進行探究。