在人類基因組中95%的基因並不編碼蛋白質，其他物種也有大量的非編碼基因。這些DNA不會被編碼成蛋白質，卻又會轉錄出非編碼RNA，它們對生命活動起什麼作用？是進化的冗餘還是神秘的緩存？
《細胞》雜誌近日刊登中國工程院院士曹雪濤團隊的研究論文，他們發現一種全新非編碼RNA分子。該分子能夠調控免疫系統的「進」與「退」，這是此前學術界從未認識和證明的。
「由於長鏈非編碼RNA（lncRNA）豐度低，業界對其功能爭議很大。」浙江大學生命科學研究院教授徐平龍在此前接受採訪時評價道，但此次發表的研究嚴謹地鑑定了所發現的一種全新lncRNA是有功能的，即能夠進行免疫調控，而曹雪濤院士正是這一機制的主要開拓者之一。
大海撈針 從浩淼細胞中層層篩選而出
細胞雖小，卻瀚如乾坤。尋找一個不知道存不存在的RNA分子，如大海撈針。
到哪裡找線索？病毒感染給了曹雪濤啟示。談到為什麼會從病毒這個「敵人」的角度考慮。曹雪濤講道：「我們中國文化講，陰中有陽、陽中有陰，這是外國人很難理解的。這一哲理指導我們對免疫系統的理解就是，激活和抑制很可能會交融在一處，那麼我們就從這個『交融點』突破解題。」
既然體內蛋白能夠識別外來的病毒RNA，能不能識別體內自身RNA呢？
科學界大部分認為不能。「免疫系統擁有識別『自我』『非我』的能力，就好像邊境衛士，對外來的侵害反應敏感，對轄內『居民』熟視無睹。」曹雪濤院士團隊成員之一、中國醫學科學院基礎醫學研究所教授姜明紅說，「但是曹老師並不這麼看，他說，究竟是不是熟視無睹，你要證明才行。」
在中國傳統哲理思想的指引下，曹雪濤鎖定了一個已知的關鍵蛋白——「RIG-I」，求證這個能與病毒RNA結合的蛋白，會不會和體內自身的RNA分子結合。
RIG-I很像一個分子水平的「老鼠夾子」，2011年有科學家解析了這個蛋白的分子結構，發現「老鼠（病毒RNA）」沒來的時候，夾子合著，兩頭的結構域相互作用，蛋白處於「閉合」狀態；一旦「老鼠」來了，與夾子的一頭結合，另一頭就會「彈開」，蛋白遂處於激活狀態。而這樣的構象變化，會引發細胞合成出關鍵的抗病毒分子——幹擾素，幹擾素分泌後被周圍細胞接受，引發抗病毒的「連鎖反應」。
研究團隊通過紫外加強RNA結合蛋白免疫沉澱（UV-RIP）的方法，將「老鼠夾子」和它獵捕的「老鼠」同時從細胞中分離出來。隨後通過蛋白質變性等方法，把「老鼠夾子」過濾掉，就獲得與RIG-I結合的所有RNA。
夾子「釣」上來的所有RNA中，有沒有未被發現的有功能的lncRNA呢？
將「撈針」的範圍鎖定夾子「釣」上來的RNA後，團隊又通過設計對應的幹擾實驗繼續縮小範圍，即看究竟哪個RNA被封殺之後，免疫活動不再被抑制。功能篩選幫助團隊鎖定了一批備選者並列出「排名」。排名靠前的RNA分子，且與特定信號通路相關的lnc-Lsm3b被鎖定，一個新的RNA分子從浩淼的小鼠巨噬細胞中經過層層篩選被「打撈」上來，並獲得了確切的序列。
團隊後續開展了多角度的證明工作，如通過幹擾、敲除、過度表達等技術，反覆證明lnc-Lsm3b能夠在病毒感染的細胞中，通過「分子誘餌」的方式鎖定RIG-I，使其不與病毒RNA結合。
海量實驗 頂級期刊的尖銳難題被逐個攻克
全新的發現，使得團隊興奮異常。沒想到的是，更大的磨礪還在後面。
團隊向頂級期刊投稿，審稿人卻要求必須用CLIP（交叉互連免疫沉澱）技術明確RNA的哪一個點和蛋白質相互作用，連接在一起。用語言很難解釋蛋白質和RNA在活體細胞內錯綜複雜的關聯，姜明紅給科技日報記者畫圖：一個長鏈RNA會結合多個蛋白，這些蛋白有的是特異連接，連得緊密，有的就是「掛」在上面，而蛋白之外還會帶上其他的RNA，「纏繞」「連帶」「虛實」……
CLIP很難做，國內實驗室極少有成熟的經驗。收到修改意見後的團隊成員開始大量查閱論文。「國外的實驗流程無法完全照搬，不同的細胞做法不同，需要重新摸條件。」團隊中主要攻關這一技術的劉倫說。
CLIP技術和RIP（RNA結合蛋白免疫沉澱）技術類似，但是卻能夠達到單個鹼基的解析度。為此，通過海量實驗，針對裂解液的成分如何影響細胞內物質，團隊開始了如指掌；不同RNA酶的脾氣也熟練掌握。
「實驗室的部分我們自己攻克了，但是測序公司表示無法進行匹配的測序工作，原因是無法合成特有的適當引物。」劉倫說，國內沒有公司生產CLIP所需引物，而RNA測序必須先反轉錄為cDNA才能夠進行，引物決定了反轉錄的準確性，決定了目標位點能否確定。實驗室自己擔負起RNA轉錄、構建cDNA文庫的工作。完成3代測序、用化學方法測量分子間的相互作用力……這些免疫研究實驗室原本並不擅長的難題被團隊逐個攻克。
按圖索驥 摸索並掌握一套獨有技術體系
根據已有發現，團隊按圖索驥，利用分子篩層析實驗證實缺失lnc-Lsm3b表達的巨噬細胞在感染病毒以後，多聚化的RIG-I蛋白顯著增加。他們推測，病毒RNA與RIG-I結合以後，能夠誘導RIG-I單體形成多聚化狀態，從而激活下遊信號通路。而lnc-Lsm3b只與單體結合，可能是通過抑制RIG-I的多聚形成抑制RIG-I的活性。
「Lsm3b只能結合單體的RIG-I蛋白、一條鏈能結合9個蛋白、結合力比病毒RNA高……」這些都是對這個全新RNA分子的多角度了解。
如同向「黑洞」中打進一束光，曹雪濤團隊在對現有知識體系顛覆的同時，肯定地回答了學界之前關於這類自身RNA分子是否存在、功能幾何的爭議。
「過去我們用別人的技術進行實驗，現在我們自己摸索並掌握一套獨有的技術。」曹雪濤說，整個研究的「練兵」不僅拓展了人類的「知識域」，還拓展了實驗室的思路和眼界。接到《細胞》雜誌編輯部發來修改要求時感受到的「不可思議」和巨大壓力，團隊成員現在已能笑談。
「只是這段RNA與人類的同源性很低。」姜明紅表示了小小的惋惜，這意味著，該發現無法直接應用於人類的新藥創製領域，但是，其他擁有人源細胞材料的機構，可以沿著這條路，進一步發現人類機體內是否存在相似的RNA。曹雪濤更看重的是，確定靶點的方法一旦被高質量地掌握，就能夠確定蛋白質的靶點，進而確定藥物作用的靶點，助力抗病毒藥物的研發。
（原標題：長期被誤解 非編碼RNA存在「認知黑洞」）