近幾年，新一代高通量測序技術（next-generation sequencing technology，NGS)又稱下一代測序技術在白血病克隆演變、診斷、預後分析、療效評價、復發預測以及藥物開發等方面得到廣泛應用，新的進展層出不窮。本文僅就應用NGS技術在白血病克隆演變、預後分析和療效評價等方面取得的最新進展作一介紹。
一、白血病的克隆演變
白血病的克隆演變和遺傳異質性代表了腫瘤發生、發展的規律，揭示這一規律對於預防預測疾病的發展，針對性的選擇治療方案至關重要。近年來，利用NGS技術，人們發現白血病的發生、發展是一個緩慢而複雜的過程。正常人就已經存在克隆造血。Xie等利用NGS分析了2728例血液學正常的非血液系統實體腫瘤患者外周血細胞中77個血液腫瘤相關基因。檢測發現，83%的突變來自於白血病、淋巴瘤相關的19個基因，大部分等位基因突變分數較低（2%~10%），提示造血細胞克隆處於擴張的早期階段。Genovese 等對12380例非白血病患者隨訪了2~7年，發現65歲以上老人的克隆造血達10%。Jaiswal等對17182例糖尿病患者進行了全外顯子測序（WES）測序，發現40歲以下人群幾乎沒有體細胞的突變發生，而70~79歲人群中體細胞突變達到9．6%，80~89歲人群達到11．7%，90歲以上人群達到18．4%。這些研究都說明了克隆造血是經常發生的且隨著年齡的增加而增加。
克隆造血的增加與白血病發生危險度的增加密切相關。鑑於血液學指標正常人群中血液腫瘤相關基因突變的高發生率且突變基因對攜帶者預後的影響尚不明確，借鑑意義不明的單克隆B細胞增多症和意義未明單克隆免疫球蛋白血症的診斷思路，Steensma等採用CHIP這個新的診斷名稱來描述骨髓或外周血細胞具有惡性血液病相關基因突變但患者血細胞計數正常或僅合併不符合骨髓增生異常症候群（MDS）的最低血細胞診斷標準的輕度減少（或稱為無意義的血細胞減少）的個體。由於基因突變率的高低與採用的檢測方法敏感度有關，如採用深度測序法，則幾乎每個健康人均可檢測到1個以上基因突變，故規定CHIP的基因突變負荷必須要達到等位基因突變分數≥2%。可作為CHIP診斷依據的突變基因譜尚無明確界定。與血液腫瘤發生密切相關的驅動基因以及其他已經在各種血液腫瘤中發生的重現性基因突變可作為診斷依據。常見的DNMT3A、TET2、JAK2、SF3B1、ASXL1、TP53、CBL、GNB1、BCOR、U2AF1、CREBBP、CUX1、SRSF2、MLL2、SETD2、SETDB1、GNAS、PPM1D和BCORL1/2突變基因可作為診斷CHIP的依據。
到目前為止，所有常見的白血病的基因突變譜，如急性髓細胞白血病（AML），MDS，急性淋巴細胞白血病（ALL），多發性骨髓瘤（MM），慢性淋巴細胞白血病（CLL）等都被揭示，而且更重要的進展是主要的白血病的克隆演變規律也逐漸呈現在我們面前。Ding等通過對8例AML患者治療前和復發後全基因組測序（WGS）基因突變譜的比較，發現與復發相關的主要有2種克隆，一種是AML本身就有的克隆，包含多種突變基因。一種是治療後又新產生的亞克隆，這種克隆包含著新的突變基因。AML患者中原始產生的白血病克隆不單單只有1 種，而是多種。化療可以消滅某些AML克隆，但無法消滅導致復發的AML克隆。
WGS檢測表明，白血病細胞可以有數十個，數百或者上千個基因異常，但大多數屬於「過客基因」，只有少量起關鍵作用的「驅動基因」是AML發生、發展的必須基因。
Schuh等利用WGS，在3例CLL患者中發現其中1例在疾病發展過程中維持原克隆不變，但另外2例卻逐漸出現與優勢克隆相伴行的新克隆。LanDau等應用WES，對149例CLL進行突變檢測發現，部分基因異常如13q缺失存在於大部分CLL患者中，且在疾病的早期就存在。而TP53、SF3B1和ATM 等僅存在部分克隆中，表現出亞克隆的特徵。在治療過程中出現的這些亞克隆與患者預後不良有關。除此之外，Rossi等還發現，原少量的伴TP53突變的亞克隆，經過治療等因素陽性選擇後，取代原有的優勢克隆，成為導致復發的優勢克隆。OJha等通過對12例CLL深度測序還發現，33%患者的優勢克隆仍然存在，而67%患者的優勢克隆在治療過程中發生變化，這些結果說明CLL在疾病進展過程中存在2種主要的克隆演變模式，即線性進展模式和分支模式。
Bolli等分析了67例MM 從初始診斷到復發過程的克隆演變模式，第一種是不同時間點MM克隆的比例和突變都沒有發生改變，第二種是克隆的突變譜沒有改變但克隆的比例發生了改變，第三種是患者在復發時在原有克隆的基礎上又產生了新的克隆，第四種是患者在復發時原來的克隆有丟失，而且還產生了2個以上的新的克隆。
MaKishima等利用WES和靶向測序技術動態檢測122例MDS患者從診斷到發展為繼發AML（sAML）造血克隆的演變過程，發現從低危MDS到高危MDS，從高危MDS到sAML，患者的基因突變和克隆造血多，有的並伴隨睡眠克隆。此外，該研究還發現，如果低危MDS患者中出現一類基因突變，如TP53、RUNX1、STAG2、KRAS、ASXL1、ZRSR2和TET2，則患者很快發展為高危MDS。如果高危MDS患者出現另一類基因突變，如FLT3、PTPN11、IDH2、NPM1、IDH1 和NRAS，則患者很容易進展為sAML。
上述研究成果進一步說明，白血病的克隆演變過程是一個順序性、多步驟基因突變的積累過程，是多基因、多克隆受到多種因素調控的過程。優勢克隆的產生，正是機體內環境和藥物的選擇性與各種亞克隆自身適應性相博弈的結果。隨著NGS測序技術的深入發展，學者們對白血病的克隆演變過程有了更加深入的認識，而且這種認識還在不斷地深化。這必將使白血病的診斷和治療模式發生翻天覆地的變化。
二、危險度分層和預後判斷
影響白血病預後的因素很多，包括患者的年齡、體能評分、染色體核型、融合基因或突變基因以及微小殘留病（MRD）等。近幾年，通過對各種白血病基因譜的分析發現，遺傳學的異常改變對白血病患者的長期生存影響很大，以AML為例，Elli等通過數學模型計算1540例AML的基因譜對其10年長期生存的影響進行分析，結果發現融合基因、基因拷貝、點突變以及基因與基因之間相互作用的異常對患者長期生存的影響為62%。而且，不同種類的遺傳學改變對患者預後的影響差別很大。Ley等對200例初診AML患者進行了WGS，WES，RNA序列和DNA 甲基化分析，在這些患者中發現了迄今已經發現的和尚未發現的融合基因和突變基因。他們將這些基因改變其按功能分為9類：轉錄因子融合基因（18%），核糖體基因（NPM1）（27%），抑癌基因（16%），DNA甲基化相關基因（44%），信號傳導通路基因（59%），染色質修飾基因（30%），髓系轉錄因子基因（22%），黏連蛋白複合體基因（13%）和剪切體複合體基因（14%）。Elli等對3項前瞻性臨床試驗的1540例AML患者進行NGS測序。他們利用數學生物統計對患者的異常遺傳學改變進行分析，並根據患者的預後，將其分為11個亞型，包括t（15：17），t（8：21），inv（16），MLL融合基因，t（6：9），NPM1，CEBPABis，TP53，染色質-剪切體，IDH2R172 等。
MaKishima等分析了401例MDS患者的基因譜和克隆演變規律，並根據患者的預後將MDS患者分為4類，Ⅰ類包括1型突變基因：FLT3、PTPN1、IDH1、NPM1、NRAS等，其5年無進展生存（PFS）為30%；Ⅱ類包括2型突變基因：TP53、GATA2、KRAS、RUNX1、STAG2、ASXL1、ZRSR2和TET2等，其5年PFS為60%；Ⅳ類為SF3B1突變，其5年PFS為100%；Ⅲ類為其他，其5年PFS為80%。
在大樣本多中心臨床試驗中引入NGS技術，還可以研究白血病各亞型中基因與基因之間的相互作用對預後的影響。如融合基因與突變基因，突變基因與突變基因相互作用的模式。Elli通過多參數預後分析發現，TP53，FLT3，BRAF，SRSF2，AXSL1，ZRSR2，RUNX1為獨立的不良預後基因，而NPM1，CEBPABis，IDH2為預後好的突變基因。NPM1 如伴有FLT3 和DNMT3A，MLLPTD 伴FLT3，DNMT3A伴IDH2R140則預後明顯不佳，而STAG2伴IDH2R140，NPM1 伴FLT3TKD 和DNMT3A伴RAD21的AML患者預後則明顯良好。
這些結果進一步說明基因與基因相互作用的複雜性。Nicolas等對106例t（8；21）和109例inv（16）AML 進行了NGS 檢測，結果發現，按照AML的8種功能分類，二者與酪氨酸激酶活化相關的基因突變，如KIT，N/KRAS，FLT3等都頻發。t（8；21）患者染色質修飾相關基因突變和黏連蛋白複合物基因突變頻發，分別為42%和18%，而inv（16）後者這二種基因突變幾乎沒有發生。高表達cKIT的CBFβ-AML患者的預後不佳，而高表達N/KRAS患者，如果不伴有KIT和FLT3基因突變則預後好。酪氨酸激酶活化相關的基因突變t（8；21）患者，如伴有染色質修飾相關基因和黏連蛋白複合物基因突變，則預後不佳，極易復發，5年復發率達60%。類似情況也發生在正常核型患者中NPM1與FLT3-ITD之間的相互作用。最新的2017年ELN 關於AML危險度分類顯示，NPM1突變伴FLT3-ITD低表達的（＜50%）患者屬於低危，而NPM1 突變伴FLT3-ITD 高表達的（＞50%）屬於中危，NPM1野生型伴FLT3-ITD低表達也是中危，只有NPM1野生型伴FLT3-ITD高表達的才屬高危患者。
大量多中心臨床試驗的結果顯示，MRD是影響白血病患者預後的主要原因，是白血病無復發率和長期生存率最重要的獨立預後因素。因此，快速、敏感、準確地檢測MRD是白血病精準治療的關鍵。目前，MRD檢測平臺主要有多參數流式細胞（MPFC）、實時定量PCR（RT-qPCR）、數字PCR和NGS技術。MPFC和RT-qPCR是目前臨床上常用的檢測平臺。MPFC是檢測白血病細胞表面的白血病相關表面抗原（LAIP）和比較與正常細胞的不同，其可用於白血病患者治療後的療效評價，危險度分層和復發預測，可覆蓋90%以上的白血病患者，敏感性達到10-5~10-4，只是MPFC在技術上目前還沒有達到標準化，需要有經驗的操作者。RT-qPCR是檢測白血病細胞的分子遺傳學異常，如融合基因，突變基因和過表達基因。其作用與MPFC相同，可覆蓋30%~60%的白血病患者，但不能檢測大部分正常核型的白血病患者。
RTqPCR對不同的靶基因檢測的敏感性不同，最高可達到10-7~10-6。由於MRD檢測技術的進步，白血病的療效評價有了新的進展，2017年ELN關於AML的診斷和治療指南中首次引入了完全緩解（CR）的新概念：CRMRD＋和CRMRD-是指誘導化療後經MFPC 或RT-qPCR 檢測MRD 為陰性的CR，因此到此水平的患者腫瘤負荷減低了104倍。NGS技術檢測MRD具有與MPFC和RTqPCR相同的敏感性和高度的一致性。到目前為止，已有多個突變基因可用於AML的MRD檢測，如NPM1、RUNX1、ASXL1等，IgH 重排可用於ALL的MRD檢測。但大部分突變基因是否可通過NGS檢測白血病的MRD，還需要進一步的研究。近年來研究發現，基於NGS可以同時定量檢測成百上千低頻率體細胞突變的特點，實時定量檢測白血病克隆的演變過程，尤其是白血病患者中的多克隆的變化規律。這對於我們評價療效，指導治療，預測復發無疑意義重大。相信在不遠的將來NGS作為白血病精準治療的衛士，在白血病的診斷和治療中發揮越來越重要的作用。
來源：臨床血液學雜誌.2017, v.30;No.213(03) 342-344+349
作者：哈爾濱血液病腫瘤研究所 邱林
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