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CAR-T療法是一種通過基因工程技術修飾患者自體T細胞，並引導淋巴細胞識別並消除表達同源靶配體的腫瘤細胞的治療方法。CAR-T療法在B細胞白血病或淋巴瘤患者中有顯著的治療效果，在多發性骨髓瘤患者中也具有良好的療效。然而，CAR-T療法存在的瓶頸限制了其廣泛應用，如毒副作用嚴重、抗原逃逸、治療持續性、異質性等，特別是在實體腫中治療效果有限。設計超越傳統結構CAR，將有助於解決這些瓶頸，將CAR-T療法擴展到更廣泛的惡性腫瘤治療領域。研究人員正在通過廣泛的工程策略來解決CAR-T療法當前的不足，以提高其安全性、有效性和適用性。
▲圖1. CAR-T療法原理
CAR有四個主要組成部分：抗原結合域，鉸鏈，跨膜域和細胞內信號域（圖2）。每部分有不同的功能，組成部件的多樣化組合，可以實現CAR分子的優化設計。
▲圖2. CAR的分子結構
3.1 抗原識別結合域
抗原結合區是CAR的細胞外部分，它識別靶抗原會觸發一系列化學和生物物理過程，激活T細胞以殺傷腫瘤細胞。CAR的抗原結合域傳統上是由可變重鏈（VH）和可變輕（VL）鏈及柔性連接物形成單鏈可變片段（scFv）。CAR包含靶向腫瘤細胞外抗原的scFv，從而實現獨立於主要組織相容性複合物（MHC）的T細胞活化。
可溶性配體是一類獨特的生物標誌物，採用CAR識別可溶性配體可以大大擴展CAR-T療法在腫瘤治療中的應用。CAR與腫瘤微環境（TME）中的可溶性配體，如轉化生長因子β（TGF-β）結合，以將實體腫瘤中常見的免疫抑制信號轉化為有效的T細胞激活劑。Chang.Z.L等人研究證明CAR可設計成靶向CD19胞外域、GFP變異體和TGF-β等各種可溶性配體且產生強有力的響應。
scFv序列通常來源於鼠或人的單克隆抗體，也被設計成更小的單納米抗體。納米抗體的特有性質是增強的靶向能力，有助於CAR-T療法在實體瘤中發揮作用。Xie,Y.J等人構建的CAR上鑲嵌著識別腫瘤微環境中EIIIB和PD-L1蛋白的納米抗體，通過在兩種不同黑色素瘤小鼠模型中測試，這些CAR-T能顯著殺死腫瘤細胞並減緩腫瘤生長及改善小鼠的存活，且沒有產生明顯的副作用。
人單鏈抗體噬菌體展示庫是scFv的另一個來源，scFv的某些特性可能對CAR功能產生影響，而不僅僅是影響識別和結合靶抗原。如VH鏈和VL鏈之間的相互作用方式，以及互補決定區的相對位置，都會影響CAR對靶抗原的特異性和親和力。另外，scFv對靶抗原的親和力是CAR功能的一個基本決定因素，親和力應足夠高以有效識別腫瘤細胞並誘導CAR信號和活化T細胞。然而，親和力過高可能會導致過度活化而導致的CAR-T細胞死亡（AICD）及產生潛在的毒性。
除單鏈抗體外小分子也可被用作CAR的抗原結合域。如zetakine CAR已開始了臨床研究。基於其它配體的CAR正在一系列惡性腫瘤的臨床前和臨床研究中進行測試，如結合靶向B細胞成熟抗原（BCMA）的增殖誘導配體（APRIL），鈣調節劑及親環素配體（TACI），急性髓性白血病（AML）的FLT3配體，自然殺傷細胞受體D（NKG2D）等。
3.2 鉸鏈和跨膜結構域
鉸鏈區能提供足夠的靈活性來克服空間位阻，以便於結合靶抗原。值得注意的是，鉸鏈長度和組成的差異會影響抗原結合和CAR信號。鉸鏈和跨膜結構域的特性也影響CAR-T細胞因子的產生和AICD。來自CD8、CD28、IgG1或IgG4的胺基酸序列已被用於CAR鉸鏈結構域（圖1）。
跨膜結構域將CAR錨定在T細胞膜上，通常來源於I型蛋白，如CD3ζ、CD28、CD4或CD8α（圖1）。跨膜結構域影響CAR的穩定性和功能，如含有CD28跨膜結構域的CAR比含有CD3ζ跨膜結構域的CAR更穩定。有趣的是，CD3ζ跨膜結構域介導了CAR的二聚作用並與內源性TCR結合，這可能有助於CAR介導的T細胞活化。含有CD8α鉸鏈和跨膜結構域的CAR-T細胞釋放的IFNγ和TNF比那些由CD28衍生的結構域對AICD的敏感性低。CD8α和CD28的跨膜域由於能夠促進CAR在細胞表面表達，目前已在多數臨床試驗中採用。
3.3 胞內信號結構域
細胞內信號結構域通常包括激活區、一個或多個共刺激域（圖1）。絕大多數CAR通過CD3ζ衍生的基於酪氨酸相關的免疫受體激活CAR-T細胞，然而，由這些介導的信號僅導致有限的T細胞的活性及持久性。共刺激信號對獲得最佳功能及持久性的T細胞是必要的。含有激活區和共刺激區的CAR-T細胞產生IL-2，並能在抗原刺激下增殖。
研究最廣泛的共刺激結構域來自CD28或4-1BB（CD137），基於這兩個結構域的CAR-T產品均獲得FDA批准。表達CD28結構域的T細胞分化為效應記憶T細胞，而含有4-1BB的T細胞分化為中央記憶T細胞。CAR-T細胞可供選擇的共刺激結構域包括MYD88和CD40、OX40（CD134）、誘導性T細胞共刺激因子（ICOS）、CD27和殺傷細胞免疫球蛋白樣受體2DS2。
基於CAR的四個模塊化組件，研究人員創新性地設計了眾多的CAR-T細胞。這些策略旨在提高CAR-T細胞治療的安全性和有效性，擴大在腫瘤治療領域的應用範圍，促進快速、可靠和高效地生產CAR-T細胞。目前CAR的設計思路總體上可以分為如下幾個方面：A.選擇新的靶點及設計新的scFv片段，但這需要大量的基礎研究，而且篩選有效和特異性的scFv也較為困難，目前大部分CAR-T是靶向TAA的，如包括CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、BCMA等。另外，目前CAR-T臨床研究所用的scFv多源於小鼠，這無形中增加了宿主對CAR-T細胞的免疫排斥反應，發生細胞毒性或降低了CAR-T的持續性。因此，開發人源化或全人源的抗體來源的scFv，降低CAR-T細胞的免疫原性，是CAR-T研究面臨的關鍵問題之一。B.改造共刺激分子，二代CAR-T是在一代CAR的基礎上增加了共刺激分子，這也是目前絕大多數公司和研究者所採用的結構。第三代CAR-T是在第二代CAR-T的基礎上加上更多的共刺激分子，但三代的CAR-T並不勝於二代CAR-T的效果，因為過多的細胞因子刺激T細胞，不但不是CAR-T的福音，還有可能會導致過度活化而導致的CAR-T細胞死亡（AICD）。 C.讓CAR-T細胞表達一些免疫相關細胞因子，比如：IL-15、IL-12、PD-1/PD-1L單抗，這樣就增加了協同作用通過免疫細胞對抗腫瘤。
目前，CAR-T細胞療法在血液癌的治療中已經取的顯著的效果，研究人員也在積極設計開發新型的CAR-T療法，期望在其它血液腫瘤以及實體瘤種發揮類似療效。尋找CD19以外的新型的有潛力的抗原靶標，減少毒副反應，克服腫瘤微環境中的免疫抑制作用是目前亟需解決的問題。相信隨著研究的深入，在不久的將來一定能開發出更加安全以及有效的CAR-T療法，為患者帶來希望。
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